普氏野马粪便DNA方法优化及应用的可行性研究

论文摘要

动物血液和肌肉等组织业已广泛用于遗传学研究,然而,采集动物组织会伤及动物且难以获得充足的样本数量,目前研究者积极探索非损伤采样方法并运用遗传学研究。迄今非损伤取样方法在濒危物种保护遗传学研究中仍面临DNA量少、DNA降解、PCR抑制物、背景DNA干扰等诸多问题,制约了该方法及其相关研究深入开展。普氏野马重引入是我国一项濒危物保护生物学的重大实践,亟待开展非损伤途径的保护遗传学研究。鉴于此,本研究以三种粪便保存方法和2种粪便DNA提取方法为自变量,以PCR成功率为因变量,比较每种处理组合的PCR成功率,建立了一种适合普氏野马粪便DNA的保存方法、提取方法以及PCR扩增方法,并探讨该方法运用于普氏野马遗传多样性研究的可行性。本研究将近缘种家马的4个微卫星位点用于50匹普氏野马粪便DNA的扩增,并扩增了线粒体DNA的12SrRNA。主要研究结果如下：(1)三种保存方法的PCR成功率存在显著性差异(P<0.05),采用酒精保存效果较好。源自保存方法与提取方法的显著交互作用(P<0.05)表明,酒精保存和手工提取方法这种处理组合的PCR成功率最高(66.1%)。(2)粪便DNA保存时效性研究表明,采用酒精保存粪样的PCR在9个月时成功率(30%)显著降低(P=0.016),而采用干燥保存方法(P=0.031)和冷冻保存方法(P=0.001)的粪便DNA的PCR成功率,则在6个月的时候显著降低。(3)本研究建立的提取方法表明CTAB、马铃薯淀粉以及BSA对于去除粪便中PCR的抑制物具有重要的作用。(4)4个微卫星位点在50个普氏野马个体中共检测到16个等位基因,等位基因最低为3个,最高为5个,平均为4个。所有检测个体中,4个微卫星微点的平均期望杂合度(He)为0.703,平均观测杂合度(Ho)为0.575。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 普氏野马的研究背景及保护现状
• 1.1.1 普氏野马形态特征
• 1.1.2 普氏野马的系统分类地位
• 1.1.3 普氏野马的变迁及保护现状
• 1.1.3.1 普氏野马的变迁
• 1.1.3.2 普氏野马的保护现状
• 1.2 普氏野马遗传多样性研究进展
• 1.2.1 生化水平
• 1.2.2 染色体水平
• 1.2.3 线粒体DNA水平
• 1.2.4 微卫星DNA水平
• 1.2.5 MHC水平
• 1.3 非损伤性取样用于保护遗传学的研究
• 1.3.1 非损伤性取样简介
• 1.3.2 粪便的非损伤性取样的应用
• 1.3.3 粪便的非损伤性取样应用面临的挑战
• 1.3.4 粪便DNA保存方法
• 1.3.5 粪便DNA提取方法
• 1.3.6 粪便DNA的PCR
• 1.4 微卫星DNA在保护遗传学中的应用
• 1.4.1 保护遗传学简介
• 1.4.2 微卫星分子标记概述
• 1.4.2.1 微卫星分子标记的发现
• 1.4.2.2 微卫星的产生机理
• 1.4.2.3 微卫星的特点
• 1.4.3 微卫星位点的筛选
• 1.4.4 微卫星多态性的检测方法
• 1.4.5 微卫星应用
• 1.5 研究目的
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要实验仪器与试剂
• 2.2.1 主要实验仪器
• 2.2.2 主要试剂及配方
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 基因组DNA提取
• 2.3.1.1 粪便DNA提取
• 2.3.1.2 血液DNA提取
• 2.3.1.3 组织样品DNA提取
• 2.3.1.4 毛发样品DNA提取
• 2.3.1.5 粪便DNA试剂盒提取法
• 2.3.2 粪便DNA保存方法和提取方法的优化实验
• 2.4 粪便DNA保存时效性分析实验
• 2.5 普氏野马在4个微卫星位点上的遗传多样性分析实验
• 2.6 PCR扩增
• 2.6.1 引物合成和溶解
• 2.6.2 PCR扩增及条件
• 2.6.3 扩增产物的检测
• 2.6.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.6.3.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 2.6.3.3 部分产物纯化、克隆及测序
• 2.7 数据分析
• 3 研究结果
• 3.1 基因组DNA琼脂糖检测结果
• 3.2 PCR扩增结果
• 3.2.1 线粒体12SrRNA的PCR扩增结果
• 3.2.2 微卫星位点的PCR扩增结果
• 3.3 部分PCR产物克隆测序结果
• 3.3.1 线粒体12SrRNA克隆测序
• 3.3.2 微卫星PCR产物测序结果
• 3.4 粪便DNA的PCR成功率
• 3.4.1 线粒体12SrRNA的PCR成功率
• 3.4.2 保存方法和提取方法优化结果
• 3.4.2.1 保存方法和提取方法优化结果
• 3.4.2.2 粪便DNA保存时效性分析实验
• 3.4.3 PCR抑制物的去除
• 3.5 普氏野马在4个微卫星位点上遗传多样性结果
• 3.5.1 已研究的4个微卫星位点多态性
• 3.5.2 在4个微卫星位点上的普氏野马遗传多样性参数
• 4 讨论
• 4.1 粪便采集过程的影响因素
• 4.2 普氏野马粪便DNA保存和提取方法的优化
• 4.3 粪便DNA的PCR成功率
• 4.4 微卫星多态性检测技术讨论
• 4.5 粪便DNA用于普氏野马遗传多样性研究的可行性
• 5 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 致谢