草原龙胆C/D类MADS-box基因克隆与表达分析

论文摘要

花器官发育的ABC模型的扩展与修饰说明植物MADS-box基因家族在花发育进程中具有重要调节功能,经过基因重复、功能分化、互作网络精调而导致被子植物花形态的多样性。从单一模式植物转向多种植物联合分析,通过比较研究,将有助于阐释花部性状发育及其多样性的分子机制。草原龙胆（Eustoma grandiflorum）为龙胆科（Gentianceae）草原龙胆属（gentian）草本观赏植物,既具有单瓣花又有重瓣花,重瓣花的四轮花器官发育正常且雄蕊数目稳定,这与重瓣花多存在雄蕊瓣化的现象不同。为探讨草原龙胆花器官发育的分子机理,针对C/D类MADS-box基因开展了以下几方面的研究:1.C/D类MADS-box基因的克隆以草原龙胆不同发育阶段的混合花芽RNA为模板,用基因特异性引物,分别利用3’-RACE和RT-PCR技术,克隆了C功能基因EgPLE1和D功能基因EgMADS1。两类基因的C末端均具有保守的AG基序Ⅰ和AG基序Ⅱ,属于AG-like亚家族。Southern杂交结果显示,EgPLE基因在基因组中可能有多个拷贝,EgMADS1基因在基因组中可能有4个拷贝。2.D类MADS-box基因的表达分析用Northern杂交技术分析了EgMADS1基因的器官特异性表达情况。结果表明,该基因仅在雌蕊、胚珠表达。3.EgMADS1基因遗传转化载体的构建为深入开展EgMADS1基因的功能研究,用Gateway技术成功构建该基因的过量表达载体和RNAi载体,转化LBA4404菌株农杆菌,用叶盘法对烟草进行农杆菌介导的遗传转化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 国内外研究动态
• 1.2.1 花发育的ABC模型及发展
• 1.2.2 植物MADS-box基因的研究进展
• 1.3 本课题的研究目的及意义
• 2 草原龙胆C类MADS-box基因的克隆及分析
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要仪器与药品
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 草原龙胆总RNA的提取
• 2.2.2 mRNA的分离纯化
• 2.2.3 3′RACE反应
• 2.2.4 PCR产物的纯化
• 2.2.5 目的片断与载体的连接
• 2.2.6 连接产物的转化
• 2.2.7 筛选阳性克隆
• 2.2.8 目的基因片段的测序与BLAST分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA的质量检测
• 2.3.2 mRNA的纯化
• 2.3.3 草原龙胆MADS-box基因3′cDNA的克隆
• 2.3.4 目的基因片段的BLAST分析
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 草原龙胆D类MADS-box基因的克隆及分析
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要仪器与药品
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 草原龙胆总RNA的提取
• 3.2.2 草原龙胆D类MADS-box基因的克隆
• 3.2.3 反转录产物PCR
• 3.2.4 PCR产物的纯化
• 3.2.5 目的片断与载体的连接
• 3.2.6 连接产物的转化
• 3.2.7 菌种保存
• 3.2.8 筛选阳性克隆
• 3.2.9 目的基因片段的测序与BLAST分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 总RNA的质量检测
• 3.3.2 RT-PCR产物的扩增及纯化
• 3.3.3 亚克隆结果
• 3.3.4 菌液PCR阳性克隆的鉴定
• 3.3.5 目的基因序列测定结果分析
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 草原龙胆C/D类MADS-box基因的Southern及Northern杂交
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 植物材料及质粒
• 4.1.2 试剂及仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 D基因的克隆
• 4.2.2 EgMADS1基因Northern和Southern探针的制备
• 4.2.3 EgPLE基因Southern探针的制备
• 4.2.4 草原龙胆各部分总RNA的提取
• 4.2.5 草原龙胆花芽DNA的提取
• 4.2.6 Northern杂交
• 4.2.7 Southern杂交
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 Northern杂交结果
• 4.3.2 Southern杂交结果
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 5 草原龙胆EgMADS1基因过量表达载体和RNAi载体的构建
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 载体构建的试验材料
• 5.1.2 试剂及仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 全长基因的扩增及纯化:
• 5.2.2 纯化产物与attB adapter的连接
• 5.2.3 attB-PCR产物纯化
• 5.2.4 BP反应
• 5.2.5 BP反应目的基因克隆的筛选及鉴定
• 5.2.6 LR反应
• 5.2.7 LR反应目的基因克隆的筛选及鉴定
• 5.2.8 农杆菌转化
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 全长基因的PCR扩增产物及纯化
• 5.3.2 attB adapter的连接及纯化
• 5.3.3 通过BP反应获得入门克隆（Entry Clones）
• 5.3.4 通过LR反应获得Expression Clones
• 5.3.5 酶切鉴定图谱
• 5.3.6 农杆菌转化
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢