鸡艾美耳球虫不同种株ITS-1、ITS-2序列的克隆和分析比较

论文摘要

球虫病是一种严重危害畜牧业、造成重大经济损失的寄生原虫病。长期以来,球虫的分类和鉴定主要依赖于卵囊和孢子囊的形态特征、寄生部位、最短潜在期、最短孢子化时间、致病性等生物学特征。随着分子生物学技术的发展,采用PCR方法对寄生虫某段具有种特异性的DNA序列进行分析开辟了寄生虫分类学研究的新纪元。内转录间隔区（Internal transcribed spacers,ITS）是一种广泛应用于寄生虫种间分类鉴定的理想遗传标记。本论文利用单卵囊分离技术成功地分离到5株鸡艾美耳球虫纯株,其中第14#虫株,其卵囊大小为22.25μm×17.38μm,卵囊形状指数为1.28;最短孢子化时间为16h;最短潜在期为81h;寄生部位为小肠前1/3部位,初步鉴定为早熟艾美耳球虫（Eimeria praecox）,为开展该种球虫生物学、分子生物学研究提供了条件。利用属特异性引物,对4种鸡艾美耳球虫基因组DNA进行PCR扩增,获得了4个虫种的ITS-1、ITS-2序列,大小范围在350bp-668bp之间,其中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）的ITS-1序列大小为668bp,ITS-2序列为550-551bp;堆型艾美耳球虫（E.acervulina）的ITS-1大小为508bp,ITS-2为406bp;和缓艾美耳球虫（E.mitis）的ITS-1大小为493bp,ITS-2为446bp;巨型艾美耳球虫（E.maxima）的ITS1有2条扩增条带,其大小分别约为550bp和426bp,ITS-2大小为350bp。根据各种艾美耳球虫ITS-1、ITS-2扩增片段数及扩增片段大小,完全可以对上述4种球虫进行鉴定和区分。将扩增产物克隆到pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,进行序列测定,选用E.tenella敏感株ITS-1、ITS-2序列,与其它三种球虫的ITS-1、ITS-2序列进行同源性比对,结果发现,4种艾美耳球虫种间的ITS-1序列同源性为41.3%-51.2%,ITS-2序列同源性为18.4%-31.6%,差异非常显着,完全可以利用两段ITS序列进行种间区分和鉴别。利用PCR技术成功地扩增出了E.tenella抗药性表型不同的7个虫株的ITS-1、ITS-2序列,结果所有虫株的ITS-1大小均为668bp,ITS-2序列中,仅马杜拉霉素抗药株为550bp,其余虫株均为551bp。对E.tenella虫株间序列同源性进行比对,发现ITS-1序列同源性为98.5%-99.9%,ITS-2序列同源性为96.2%-99.6%,各株间均有一些核苷酸差异,利用这些差异,有望采用一些特定的方法,对虫株进行区分和鉴别。上述工作的开展,丰富了鸡球虫内转录间隔区序列的遗传资料,对于准确鉴定球虫虫种及具有不同表型特征的虫株、对球虫抗药性的产生机制和分子检测,对开展球虫分子流行病学调查、正确制定防治方案,有效地预防和治疗球虫病,具有重要的理论和经济意义。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 综述一：ITS 序列及其在寄生虫分类中的应用
• 1 隐孢子虫的 ITS 序列研究进展
• 2 鸡异刺线虫的 ITS 序列研究进展
• 3 弓形虫 ITS 序列研究进展
• 4 食道口线虫 ITS 序列研究进展
• 5 卡式住白细胞虫 ITS 序列研究进展
• 6 片形吸虫 ITS 序列研究进展
• 7 鸡艾美耳球虫 ITS 序列研究进展
• 8 展望
• 综述二 鸡球虫抗药株遗传学变异和蛋白质差异表达研究进展..
• 1 鸡艾美耳球虫的遗传学变异研究
• 2 鸡艾美耳球虫的蛋白质差异表达研究
• 3 展望
• 第1章 早熟艾美耳球虫纯种的分离和初步鉴定
• 1 材料与方法
• 2 实验结果
• 3 讨论
• 第2章 鸡艾美耳球虫不同种株ITS-1、ITS-2序列的克隆和分析比较
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第3章 小结
• 参考文献
• 读硕士期间发表的论文
• 致谢