肾移植受者术前MICA抗体阳性对移植后早期急性排斥反应的影响

论文摘要

目的和意义：外科技术的不断进步和新型免疫抑制剂的产生,肾脏移植已经成为临床上治疗肾功能衰竭的最有效手段。急性排斥反应是肾移植术后常见的并发症,是导致移植物功能丧失和长期存活失败的重要危险因素之一。排斥反应分为细胞性排斥反应和体液性排斥反应,其中细胞免疫在排斥反应过程中起着重要作用,但体液免疫在肾移植术后排斥反应中也起着非常重要的作用。一般认为针对人类组织相容性抗原（Human leucocyte antigen, HLA）的抗体为与肾移植术后排斥反应及移植肾存活率密切相关的体液性因素,特别是移植前受者体内针对供者的特异性抗体可以导致超急性排斥反应发生。然而,即便是供受者之间HLA基因完全匹配,肾移植术后排斥反应仍可能发生。因此,人们认识到一些非HLA抗体也可以介导体液性排斥反应。MIC基因位于人体6号染色体上,是跨越人类组织相容复合物1（MHC-I）类2Mb长度区域的基因家族,此家族与经典的HLA-I类基因同源性很高,但分子结构和功能不同,它包括MICA、MICB、MICC、MICD、 MICE、MICF6个成员,其中只有MICA和MICB编码、表达。MIC基因编码产物结构与MHC-I类分子结构类似,含383-389个氨基酸的多肽,包含有3个胞外结构域（α1,α2,α3）,α1、α2形成了抗原结合部位。MIC基因编码的分子是与NKG2D分子相结合,不与T细胞受体（T cell receptor,TCR）相结合,不与β2微球蛋白相连,不与肽段结合,与抗原加工相关转运体（transporter associated with antigenprocessing, TAP）无关。MICA基因具有高度多态性,目前至少发现61个等位基因,其多态性主要体现在外显子3,4和跨膜区的微卫星序列。经典的HLA-I类分子广泛分布于人体有核细胞,MICA基因主要表达于上皮细胞和成纤维细胞,尤其是肠道上皮细胞,也表达在大多数上皮性肿瘤细胞（胃癌、肺癌等）中,并主要与活化的巨噬细胞、CD8+T细胞以及NK细胞上的NKG2D/DAP10受体结合,激活这些细胞的细胞毒作用,诱导合成INF-γ等细胞因子,破坏移植物功能。MICA基因还存在明显的种族差异性,白种人群中MICA的多态性,MICA008基因频率最高（53%）、MICA002（13%）、MICA009（3%）日本人群中MICA008基因频率最高（30.8%）、MICA009（16.5%）、MICA007最罕见。主要组织相容性复合体Ⅰ类相关链A抗原（major histocompatibility complex class Ⅰ-related chain A, MICA）作为目前非HLA抗原中重要的具有高度多态性的糖蛋白抗原,是细胞和体液免疫应答的多态性分子。MICA抗原可能在移植排斥中通过激活抗体介导或细胞介导的免疫反应而起作用。Hankey等通过免疫组化的方法检测移植肾脏或胰腺组织中MICA基因表达,在所有出现急性肾小管坏死（ATN）以及急性排斥反应的患者组织中都出现MICA基因的表达,在正常肾脏组织中没有MICA基因的表达,提示细胞表面MICA基因表达与细胞损伤之间存在关联。MICA抗原作为一个多态性抗原,能够诱导移植肾患者产生特异性抗体。有研究证实许多配型良好的移植患者近期急性排斥反应和远期慢性移植物血管病发生率却高于配型不佳的移植患者,尽管大多数发生排斥反应的肾移植受体会产生HLA抗体,但部分不产生HLA抗体却发生移植排斥的受者中有1/3以上存在MICA抗体,2005年KazuoMizutani对肾移植受者发生排斥反应的肾脏透析洗脱液的研究发现MICA抗体与移植肾功能和存活有关,也参与了排斥反应过程中的变化,提示MICA抗体可能影响移植肾存活率,2007年Arundhati回顾性的研究了185例肾移植术后患者血清标本,发现MICA抗体阳性组患者AR发生率为33%,MICA抗体阴性组AR发生率为14%（P=0.03）。以上研究均证明MICA抗体与肾移植术后排斥反应和移植物丢失具有明显相关性。所以MICA抗体与肾移植的关系更值得关注。本课题就MICA抗体在等候肾脏移植的人群中的抗体特异性分析及术前MICA抗体对。肾移植术后早期急性排斥反应发生、移植肾功能的影响等方面展开一些探讨和研究。第一部分MICA抗体在等候肾脏移植受者中的抗体特异性分析方法：选取2009年12月-2010年10月行MICA抗体检测及MICA抗体特异性分析的197例肾移植受者。MICA荧光微球由邹义洲教授惠赠,包被10种MICA抗原,即MICA001, MICA002, MICA004, MICA007, MICA009, MICA012, MICA0015、MICA017, MICA018, MICA019, MICA027。采用液相芯片分析技术,在包被已知MICA抗原的荧光微球中加入患者血清,再加入R-藻红蛋白（PE）标记的羊抗人IgG,重悬荧光微球,Luminex机上阅读。使用Data Collector Version1.7软件进行数据采集,以双色激光分别读取每个MICA抗原>100个微球,经分子PE荧光强度获得cut-off分值,判读出0、2、4、8,将OD值≥4定为抗MICA抗体阳性,并获得抗MICA抗体特异性。根据抗MICA抗体是否阳性分为抗MICA抗体（+）组和抗MICA抗体（-）组,在MICA抗体（+）组中计算各特异性MICA抗体的频率（某特异性抗体出现频率=该特异性抗体出现次数/所有特异性抗体出现的总次数）及表达单特性抗体、多特异性抗体的受者占所有MICA抗体阳性者的百分比。结果：197例术前的肾移植受者中,45例检测到MICA抗体,阳性率为22.84%。检测的MICA抗体分别为：1例为MICA007、027;1例为MICA001、002、007、012、017、018、019;1例为MICA001;2例为WeakMICA001;4例为WeakMICA019;1例为MICA007、weak027;9例为MICA019;1例为MICA019、027、weak004、009;1例为MICA001、weak019;1例为MICA002、019;2例为MICA002、018、007、019、001、012、017、015、027、004、009;1例为MICA019、027、004、009、002、007、018;1例为MICA001、018、004、009、027;1例为MICA001、018、012;1例为MICA027、009、004、019;2例为MICA027、009、004;1例为001、002、018、027；1例为004、009、027、019、007、018；1例为MICA007;1例为MICA015;1例为MICA002、018、019。其中单特异性MICA抗体有18例,多特异性MICA抗体（特异性抗体≥2个）有17例。MICA019抗体频率为65.7%（23/35）、MICA027抗体频率为34.3%、 MICA001抗体频率为28.6%,MICA004、009、018抗体频率为25.7%,MICA007抗体频率为22.9%,MICA002抗体频率为20%,MICA012抗体频率为11.4%,MICA015、017抗体频率均为8.6%。常见为MICA019、027、001、004、009、018等抗体。45例阳性受者中单特异性抗体18例（51.4%）,多特异性抗体17例（48.6%）。第二部分MICA抗体对肾移植术后影响的相关性研究方法：检测2009-2010年本院197例未使用免疫抑制剂的肾移植受者术前MICA抗体及其特异性,随访其中139例接受肾移植手术的受者术后早期急性排斥反应（AR）和移植肾功能。根据抗MICA抗体是否阳性分为抗MICA抗体（+）组和抗MICA抗体（-）组。MICA抗体检测采用液相芯片分析技术,在包被已知MICA抗原的荧光微球中加入患者血清,再加入R-藻红蛋白（PE）标记的羊抗人IgG,重悬荧光微球,Luminex机上阅读。使用Data Collector Versionl.7软件进行数据采集,以双色激光分别读取每个MICA抗原>100个微球,经分子PE荧光强度获得cut-off分值,判读出0、2、4、8,将OD值≥4定为抗MICA抗体阳性,并获得MICA抗体特异性。采集139例移植受者年龄、性别、术后免疫抑制方案、早期急性排斥反应（AR）发生与否,术后7d内的血肌酐及24小时尿量、移植肾功能恢复时间等资料,两组间比较。AR抗排斥治疗方案：给予甲基强的松龙（MP）冲击治疗,剂量为0.5g、0.25g、0.25g,连续3d。如果肾功能无明显好转或继续恶化,使用环磷酰胺冲击治疗,疗程3-5d,并血液透析过渡等综合治疗。统计学方法：数据处理采用SPSS13.0统计软件进行,计量资料比较采用两独立样本t检验,计数资料比较采用χ2检验、校正χ2检验或Fisher确切概率检验,重复测量数据的方差分析。P<0.05表示差异有显著统计学意义。结果：已知MICA抗体情况的197例受者中有139例接受移植,均为尸体供肾,供受者ABO血型相同,术前淋巴细胞毒试验阴性。患者术后免疫抑制方案均为：抗胸腺细胞球蛋白（ATG）+他克莫司（Tacrolimus,Tac）+霉酚酸酯（Mycophenolate,MMF）+强的松（Prednisone,Pred）。移植受者两组间年龄、性别等因素差异无统计学意义（P>0.05）。其中39例发生了早期AR（平均急排率28.1%）。45例MICA抗体阳性受者中有38例接受移植,其中14例发生了早期AR（急排率36.8%）；152例MICA抗体阴性受者中有101例接受移植,其中25例发生早期AR（急排率24.8%）；MICA抗体阳性与MICA抗体阴性之间早期AR率差异无显著统计学意义。18例单特异性抗体受者中有4例发生早期AR（急排率22.2%）,17例多特异性抗体受者中有7例发生早期AR（急排率41.2%）,两组急排率差异无显著统计学意义（χ2=1.46,P>0.05）。而美国Zou等报道254例受者免疫抑制药物有效浓度治疗下的MICA抗体阳性率为13.4%,两组间差异显著（χ2=6.867,P=0.009<0.01）。参与术后随访的MICA抗体阳性受者共38例,其中7例因无法获取病例血肌酐资料而导致数据丢失,已知资料31例MICA抗体阳性受者术后1周内血肌酐水平,参与术后随访的MICA抗体阴性受者101例,其中19例因无法获得病例血肌酐资料而导致数据丢失,已知资料82例MICA抗体阴性受者术后1周内血肌酐水平,两组术后1周内血肌酐比较差异无统计学意义（F=0.001,P=0.979>0.05）,说明组别效应在术后1周不同时间内的对血肌酐的影响效应相同（图4.1,表4.1）；两组时间差异有显著统计学差异（F=216.053,P=0.000<0.05）,说明术后不同时间的血肌酐水平之间有差异。时间和组别无交互作用（F=0.797,P=0.363>0.05）,提示组别差异不随时间变化而变化,提示术后第7天两组血肌酐之间的差异无统计学意义。已知资料31例MICA抗体阳性受者术后1周内尿量,因20例受者无法获得病例尿量资料而导致数据丢失,已知资料81例MICA抗体阴性受者术后1周内尿量,两组术后1周内尿量比较差异无统计学意义（F=0.006,P=0.940>0.05）说明组别效应对术后1周内尿量水平的影响相同（图4.2,表4.2）；两组时间差异无统计学意义（F=49.654,P=0.000<0.05）,说明术后不同时间的尿量水平有差异。时间和组别无交互作用（F=0.122,P=0.947>0.05）,提示组别差异不随时间变化而变化,提示术后第7天两组尿量之间的差异无统计学意义。18例中9例无法获得血肌酐数据导致数据丢失,已知资料9例单特异性抗体受者术后7d血CR （202.9±130.2） umol/L,17例中3例无法获得血肌酐资料导致数据丢失,已知资料14例多特异性抗体受者术后7d血CR （193.3±135.9） u mol/L,两组术后7d血CR比较差异无统计学意义（t=0.168,P=0.868>0.05）；已知资料9例单特异性抗体受者术后7d尿量（2752.8±594.6）mL,已知资料14例多种特异性抗体受者术后7d尿量（2838.1±698.0）mL,两组术后7d尿量比较差异无统计学意义（t=-0.302,P=0.765>0.05）；18例单特异抗体组中6例无法获取移植肾恢复时间资料,已知资料12例单特异性抗体组移植肾功能恢复时间为（14.0±14.2）天,17例多特异性抗体组移植肾功能恢复时间为（20.0±21.5）天,两组移植肾功能恢复时间比较差异无统计学意义（t=-0.842,P=0.407>0.05）。结论：等候肾移植受者术前MICA抗体阳性率22.84%。MICA抗体中抗MICA019抗体频率65.7%。推测MICA019为人群分布中较常见基因,是表现高频率抗体的原因。MICA抗体单特异性与多特异性比例接近（51.4%vs48.6%）,提示MICA抗体的产生不是单一途径,可能包含多种因素,说明应对抗体产生途径进行深入探讨。虽然MICA抗体阳性组与阴性组相比早期AR率之间差异无显著性,但是移植受者术前MICA抗体阳性对增加移植后早期AR率（28.1%↑36.8%,24.8%↑36.8%）具有独立的影响,早期AR率的增加幅度为8.7%-12%,具有临床意义。因此,临床医生应重视肾移植术前MICA抗体。研究还发现,本文调查197例术前的MICA抗体阳性率22.84%与Zou等调查的254例免疫抑制有效浓度范围内的等待肾移植受者的MICA抗体阳性率13.4%之间差异具有显著性,提示免疫抑制药物可抑制MICA抗体的产生。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 MICA抗体在等待肾移植受者中抗体特异性分析
• 一 材料和方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 第二章 MICA抗体对肾移植术后影响的相关性研究
• 一 材料与方法
• 二 结果
• 三 讨论
• 四 结论
• 参考文献
• 全文小结
• 缩略语中英文对照表
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 统计学审稿证明