论文摘要
目的:白藜芦醇（Resveratrol,RES）最初作为葡萄属植物的植物抗毒素被发现,多种植物在病原菌侵染等外界刺激下植株不同部位均能够合成RES,葡萄树遭真菌感染后就能够产生RES来抵御病原微生物的损害,国外有学者研究认为白藜芦醇对多种人体病原菌有抑制作用,对部分革兰阳性细菌和皮肤癣菌效果显著。由于关于白藜芦醇抑菌作用的研究报道甚少,对多种细菌的作用效果和机制还不甚明确,因此为了更好的探讨白藜芦醇的抗菌作用,进一步明确抗菌机制,为临床应用打下基础,我们对白藜芦醇的体外抗菌作用进行研究。1白藜芦醇对细菌的抑制作用及其机制研究方法:依据临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）标准M7-A5,采用微量肉汤稀释法,用M-H肉汤对RES进行定量抗菌实验,获得白藜芦醇对葡萄球菌,铜绿假单胞菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentrations,MIC）。同时电镜观察RES对细菌超微结构的影响,电镜标本的制备采用含药平板接种法,含药平板的最终药物浓度为0.128mg/ml,接种标准菌株ATCC29213,于35℃孵育1824小时,按照常规制备扫描和透射显微镜样品。激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope,LSCM）标本的留取采用宏量液体稀释法,倍比稀释RES液,配制成RES终浓度分别为0.032,0.064,0.128mg/ml的M-H肉汤培养液。接种适量菌体细胞,终浓度为104CFU/ml,置于35℃培养24小时后按照常规制备LSCM标本。结果:RES对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（MSSA）的MIC50和MIC90分别为0.256和0.512mg/ml,对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA）的MIC50和MIC90分别为0.256和0.512mg/ml,对凝固酶阴性葡萄球菌（CONS）的MIC50和MIC90均为0.256mg/ml。在最高试验浓度1.024mg/ml浓度下对大肠杆菌和铜绿假单胞菌无明显抑制作用。通过扫描电镜观察RES对葡萄球菌形态超微结构的影响,可以清楚的看到正常葡萄球菌的菌体形态规则,大小基本一致,排列整齐,细胞结构正常。经过0.128 mg/ml RES作用的葡萄球菌形态不规则,大小不等,细胞壁皱褶周围多刺状突起,有部分菌体细胞破裂。正常葡萄球菌的透射电镜超薄切片照片显示菌体细胞结构完整清晰,细胞壁边缘整齐,菌体的外膜、细胞壁、胞浆膜、染色体等清晰可见。与0.128mg/ml RES作用后透射电镜超薄切片照片显示菌体细胞壁层次不清,细胞器结构模糊,细胞质内含物大多消失,出现大量空泡。LSCM结果显示,经过中低浓度RES处理后,菌体的平均细胞面积和荧光强度增强高于对照组,随着RES浓度升高,又呈现下降趋势。实验结果表明,RES对葡萄球菌有较好的抗菌作用,电镜照片证实了RES对菌体的破坏作用,LSCM结果说明RES能够影响胞内物质的合成,干扰菌体正常的生长代谢。但在本实验系列浓度下对革兰阴性的大肠杆菌和铜绿假单胞菌无明显抑制作用。2白藜芦醇对真菌的抑制作用及其机制研究方法:我们参照CLSI提出的丝状真菌微量法药敏试验的初步试验实验条件（M38-P）和酵母菌微量法药敏实验的初步实验条件（M27-P）,测定RES对红色毛癣菌（T.r）,石膏样小孢子菌（M.g）以及白色念珠菌的MIC。同时电镜观察RES对真菌超微结构的影响,电镜标本的制备采用含药平板接种法,含药平板的最终药物浓度为0.032mg/ml,接种后于27℃孵育57天,按照常规制备扫描和透射显微镜样品。结果:RES对红色毛癣菌的MIC50和MIC90均为0.032 mg/ml ,对石膏样小孢子菌的MIC50和MIC90分别为0.032mg/ml和0.064mg/ml。在最高试验浓度1.024mg/ml浓度下对白色念珠菌无明显抑制作用。通过扫描电镜观察RES对皮肤癣菌形态超微结构的影响,可以清楚的看到正常对照组菌丝生长良好,菌丝表面光滑饱满,有分枝,菌丝粗细均匀;经过浓度为0.032mg/ml的RES作用后,菌丝出现明显的破坏性裂隙,表层剥离穿孔,多有断裂,细胞内容物流失。透射电镜观察可见正常对照组菌丝切面细胞壁完整,厚薄均匀,胞质内可以见到线粒体,细胞核等细胞器。经过0.032mg/ml的RES作用后,核膜断裂、溶解消失,线粒体内出现空泡,线粒体呈现致密化、髓样化特征。实验结果表明,RES对皮肤癣菌有非常良好的抗菌作用,电镜照片证实了RES对菌体的破坏作用,但对白色念珠菌作用效果不佳。结论:1白藜芦醇在较低的浓度下对葡萄球菌和皮肤癣菌即有很好的抑菌效果,对皮肤癣菌的抑菌作用尤为显著。为临床应用和新药研究提供依据,有望成为临床治疗感染的一种新途径。2通过以上实验我们初步推断RES干扰葡萄球菌细胞壁的合成同时损伤细胞膜,影响菌体正常的细胞周期,抑制胞内物质的复制。对皮肤癣菌的抑制作用可能是破坏细胞壁或干扰细胞壁的合成,而后通过破损的细胞壁进入细胞内部,药物又造成基质和细胞器的破坏,或是药物进入细胞壁后,使细胞内离子平衡失调,导致PH值渗透压等改变损伤基质和细胞器,或是两种机制同时协同作用的结果。
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