黏型小麦雄性不育系育性相关基因的遗传分析与表达谱研究

论文摘要

黏类小麦雄性不育系是指小麦黏型（K型）和偏型（Ven型）等一类既易保持又易恢复、且种子饱满、保持系与恢复系来源都分布在普通小麦推广品种（系）内的小麦雄性不育系的总称。黏类小麦细胞质雄性不育系育性基因单一、不育性彻底、易恢复性高,是一种很有应用潜力的优良雄性不育类型,为小麦雄性不育研究和杂种优势利用提供了极有利的材料基础。本研究利用上述材料,通过对黏型小麦细胞质雄性不育恢复基因的遗传分析和分子标记筛选,以确定其恢复基因的作用方式,并试图得到与恢复基因紧密连锁的SSR标记,进而为杂交小麦分子标记辅助选择育种奠定坚实基础;同时以SSH技术分别构建了不育和可育条件下基因特异表达的抑制差减杂交cDNA文库,通过对两个cDNA文库的克隆测序、EST序列BLASTx分析,探讨了黏型小麦细胞质雄性不育系在不育和可育条件下育性相关表达基因的种类、功能和参与相关生化代谢途径的异同,旨在探索黏型小麦细胞质雄性不育的分子机制。获得下述重要结果:1、本论文以细胞质雄性不育系ms（Kots）-90-110、恢复系rk5451及ms（Kots）-90-110/ rk5451组合的F2,BF1和BC1F1群体为材料,连续两年对分离群体的育性分离情况进行了统计,对恢复基因的遗传规律进行了分析。结果表明,黏型小麦雄性不育的育性恢复主要受一对主效显性恢复基因控制;鉴于F2的育性恢复既有质量性状的特征,又有数量性状的特征,且易受环境因素的影响,推测该育性恢复性状还受微效恢复基因的影响;利用杂交、回交和自交育成了关于小麦黏型CMS育性恢复基因的拟近等基因系（INIL）和近等基因系（NIL）,可用于恢复基因定位及分离等研究。2、对黏型小麦雄性不育系及杂种F1配子传递方式分析,发现黏型小麦雄性不育系具有配子体不育的特征。供试ms（Kots）-90-110/RK5451//90-110的BC1F1分离群体明显偏离1:1的分离比,ms（Kots）-90-110与rk5451自交F2后代全都表现可育,无不育株,且自交结实率F2明显高于F1,进一步表明黏型小麦雄性不育系杂种F1是以配子体不育方式传递的。3、为了进一步探索黏型小麦育性恢复基因的遗传机理。以ms（Kots）-90-110/ rK5451//90-110的BC1F1代分离群体为研究对象,分别用定位于1B短臂染色体上的18对和6B染色体上的47对SSR引物对黏型小麦雄性不育育性恢复基因进行分子标记。初步筛选出Wms273和Wmc406两对揭示育性恢复基因多态性的引物,用132株BC1F1回交群体对这2对引物进行进一步检测,得出Wmc406与黏型小麦细胞质雄性不育系1BS上的恢复基因连锁,遗传距离为7.6cM。标记Wmc406可直接用于黏型小麦育性恢复基因的分子标记辅助选择。4、利用抑制差减杂交技术构建了黏型小麦雄性不育育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明,差减杂交效率较高,质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选200个阳性克隆进行测序,获得100余条高质量的表达序列标签（EST）。对序列进行BLAST比对及功能注释,比较了不育和可育cDNA文库的基因表达谱,发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高,在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因,这些基因很可能与育性相关。5、根据标签序列的比对结果,选择了4个与育性相关的基因片段进行电子延伸,克隆了4个育性相关基因的cDNA全长序列,并设计特异性引物,进行了RT-PCR验证。对这些基因的氨基酸序列、结构域、疏水性及系统进化情况进行了分析,其生物学功能尚需进一步构建相应的表达载体进行验证。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦杂种优势的研究概况
• 1.1.1 国内外小麦杂种优势的研究进展
• 1.1.2 小麦杂种优势利用的几种途径
• 1.2.细胞质雄性不育的遗传机理
• 1.2.1 细胞质雄性不育的细胞学研究
• 1.2.2 细胞质雄性不育的生理生化研究
• 1.2.3 细胞质雄性不育的分子机理研究
• 1.3 分子生物学育种研究的进展及其应用
• 1.3.1 DNA 分子标记的技术
• 1.3.2 DNA 分子标记的建立
• 1.3.3 分子标记辅助育种
• 1.3.4 小麦雄性不育的基因工程研究
• 1.4 功能基因组学研究技术
• 1.4.1 差异显示反转录PCR 技术
• 1.4.2 cDNA 扩增片段长度多态性
• 1.4.3 cDNA 代表性差异分析
• 1.4.4 抑制消减杂交
• 1.4.5 表达序列标签
• 1.4.6 基因表达序列分析
• 1.4.7 cDNA 微阵列和DNA 芯片技术
• 1.4.8 正向和反向遗传学研究
• 1.4.9 蛋白质组学的研究
• 1.4.10 生物信息学
• 1.5 本研究的目的意义及设想
• 第二章 黏型小麦雄性不育系恢复特异性遗传规律的研究
• 2.1 供试材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 育性调查与统计
• 2.2.2 近等基因系的培育
• 1 的恢复度调查'>2.2.3 杂种F₁的恢复度调查
• 2.2.4 后代群体的育性考察
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 近等基因系的检测与分析
• 1 的恢复情况'>2.3.2 F₁的恢复情况
• 2、BF₁和BC₁F₁ 的后代分离情况'>2.3.3 F₂、BF₁和BC₁F₁的后代分离情况
• 2.4 讨论
• 2.4.1 育性指标和育性的划分
• 2.4.2 黏类小麦雄性不育系恢复机理研究
• 1 配子传递率的遗传机理'>2.4.3 黏型小麦雄性不育系杂种F₁配子传递率的遗传机理
• 第三章 黏型小麦雄性不育恢复基因的SSR 分子标记
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试材料
• 3.1.2 引物
• 3.1.3 主要生化试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 材料的准备
• 3.2.2 基因组DNA 的提取
• 3.2.3 PCR 及电泳
• 3.2.4 遗传距离计算
• 3.3 结果与分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 利用近等基因系及分离群体分组分析法筛选紧密连锁标记的有效性
• 3.4.2 SSR 分析技术筛选紧密连锁分子标记的有效性
• 第四章 黏型小麦雄性不育相关基因SSH 文库的构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 材料及其处理
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 实验中所涉及引物
• 4.1.5 实验设计方案
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 小麦总RNA 的提取
• 4.2.2 小麦总RNA 的DNase 处理
• 4.2.3 mRNA 的分离
• 4.2.4 第一条链的合成
• 4.2.5 第二条链的合成（dscDNA 合成）
• 4.2.6 RsaⅠ酶消化
• 4.2.7 接头连接
• 4.2.8 第一轮杂交
• 4.2.9 第二轮杂交
• 4.2.10 第一轮PCR 扩增
• 4.2.11 第二轮PCR 扩增
• 4.2.12 PCR 产物的回收和纯化
• 4.2.13 克隆转化
• 4.2.14 序列测定和 BLAST 分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 小麦花药总RNA 质量检测
• 4.3.2 SSH cDNA 文库的评价
• 4.3.3 差异表达cDNA 的PCR 产物检测
• 4.3.4 EST 测序分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 取样时期必须严格对应一致
• 4.4.2 细胞质雄性不育中花粉发育期基因的特异表达
• 4.4.3 消减文库的筛选方法及其意义
• 4.4.4 ATP 酶与细胞质雄性不育
• 4.4.5 细胞骨架与细胞质雄性不育
• 第五章 育性差异片段的电子克隆及RT-PCR 验证
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试材料
• 5.1.2 差异表达基因的电子延伸
• 5.1.3 小麦花药总RNA 的提取和纯化
• 5.1.4 cDNA 第一条链合成
• 5.1.5 RT-PCR 所用引物、反应体系及程序
• 5.1.6 目的片段的回收、克隆转化及测序
• 5.1.7 序列分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 泛素结合酶基因的克隆与分析
• 5.2.2 MADS-box 转录因子TaAGL7 基因的克隆与分析
• 5.2.3 可溶性淀粉合成酶基因的克隆与分析
• 5.2.4 胞质苹果酸脱氢酶基因的克隆与分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 泛素结合酶与细胞质雄性不育
• 5.3.2 MADS-box 转录因子TaAGL7 与细胞质雄性不育
• 5.3.3 可溶性淀粉合成酶与细胞质雄性不育
• 5.3.4 胞质苹果酸脱氢酶与细胞质雄性不育
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词与英汉对照
• 致谢
• 作者简介