嗜热酶APE1547酰基氨肽酶活性及功能结构域的研究

论文摘要

酶的功能与其结构紧密相关,应用结构生物学及蛋白质工程学等理论方法进行新酶设计是酶工程研究的重要内容。来自超嗜热古细菌Aeropyrum pernix K1的超嗜热酰基氨肽酶/酯酶APE1547的晶体结构已经解析,该酶含有两个独立的结构域:催化结构域和推进器结构域。通过蛋白质的结构对比,发现其催化结构域与脂肪酶/酯酶的结构十分相似,同属α/β水解酶催化结构域。为探索两个结构域的功能,本论文分别克隆表达了单独的推进器结构域和α/β水解酶催化结构域。结果表明,单独的催化结构域仍具有酯酶活性,但活性和稳定性都降低。推进器结构域蛋白有较高的稳定性,对催化结构域形成正确折叠,维持APE1547的高稳定性具有重要作用。本研究为探讨嗜热酯酶APE1547的嗜热机理、研究酶的结构与功能关系方面提供了理论依据。

论文目录

• 内容提要
• 第一章 前言
• 1.1 古细菌
• 1.1.1 古细菌的分类
• 1.1.2 古细菌的形态与结构
• 1.1.3 古细菌的遗传与代谢
• 1.1.4 古细菌的繁殖及生态
• 1.1.5 代表性古细菌
• 1.1.6 古细菌研究展望
• 1.2 嗜热酶
• 1.2.1 嗜热酶的稳定性机制
• 1.2.2 嗜热酶的应用
• 1.3 脯氨酰寡肽酶家族
• 1.3.1 POP（prolyl oligopeptidase）家族简介
• 1.3.2 酰基氨肽酶/酰基肽水解酶简介
• 1.3.3 脯氨酰寡肽酶家族的结构特征
• 1.4 嗜热酶APE1547
• 1.4.1 嗜热酶APE1547 简介
• 1.4.2 嗜热酶APE1547 的结构研究进展
• 1.5 本论文研究背景与设计思想
• 1.6 参考文献
• 第二章 APE1547 酰基氨肽酶性质及钙离子对酶活的影响
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验试剂
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 酰基氨肽酶活力测定
• 2.3.3 温度对酶活力的影响
• 2.3.4 pH 对酶活力的影响
• 2.3.5 金属离子对酶活力的影响
• 2.3.6 氨基酸对酶活力的影响
• 2.3.7 酶的热稳定性研究
• 2 对酰基氨肽酶的影响'>2.3.8 不同浓度的CaCl₂对酰基氨肽酶的影响
• 2+对酶荧光的猝灭'>2.3.9 Ca²⁺对酶荧光的猝灭
• 2+浓度变化的研究'>2.3.10 在最适温度下二级结构随Ca²⁺浓度变化的研究
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 底物特异性及动力学
• 2.4.2 温度对酶活力的影响
• 2.4.3 pH 对酶活力的影响
• 2.4.4 金属离子对酶活力的影响
• 2.4.5 氨基酸对APE1547 酯酶活力和酰基氨肽酶的影响
• 2 对酰基氨肽酶活力的影响'>2.4.6 不同浓度的CaCl₂对酰基氨肽酶活力的影响
• 2.4.7 荧光猝灭及荧光猝灭类型的确定
• 2.4.8 钙离子与酶结合常数和结合位点数
• 2+浓度变化的研究'>2.4.9 在最适温度下二级结构随Ca²⁺浓度变化的研究
• 2.5 小结
• 2.6 参考文献
• 第三章 推进器结构域的基因克隆、表达、纯化及其性质研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与仪器
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 推进器结构域的基因克隆
• 3.3.2 重组蛋白的表达与纯化
• 3.3.3 蛋白质浓度的测定
• 3.3.4 圆二色谱测定
• 3.3.5 荧光光谱测定
• 3.3.6 差式扫描量热测定酶热力学常数
• 3.3.7 热稳定性测定
• 3.3.8 盐酸胍和尿素诱导变性
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 推进器结构域蛋白重组质粒的构建
• 3.4.2 推进器结构域蛋白表达条件的优化及分离纯化
• 3.4.3 重组蛋白的热稳定性研究
• 3.4.4 变性剂对蛋白稳定性的影响
• 3.5 小结
• 3.6 参考文献
• 第四章 催化结构域的克隆、表达、纯化及性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料与仪器
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 催化结构域表达载体的构建
• 4.3.2 重组蛋白表达条件的优化
• 4.3.3 重组蛋白的分离纯化
• 4.3.4 蛋白浓度的测定
• 4.3.5 酯酶活力测定
• 4.3.6 温度对酶活力的影响
• 4.3.7 pH 对酶活力的影响
• 4.3.8 动力学测定
• 4.3.9 酯酶的底物特异性
• 4.3.10 金属离子和表面活性剂对酶活的影响
• 4.3.11 酶的热稳定性测定
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 催化结构域
• 4.4.2 重组C1 和C2 蛋白的诱导表达
• 4.4.3 催化结构域蛋白的分离纯化
• 4.4.4 温度对催化结构域蛋白酯酶活力的影响
• 4.4.5 pH 对酶活的影响
• 4.4.6 动力学
• 4.4.7 底物特异性
• 4.4.8 金属离子对酶活的影响
• 4.4.9 重组蛋白的热稳定性
• 4.4.10 讨论
• 4.5 小结
• 4.6 参考文献
• 结论与展望
• 创新点
• 攻读博士期间主要成果
• 致谢
• 中文摘要
• ABSTRACT