mRNA水平水稻品质相关基因的大规模鉴定及应用初探

论文摘要

本论文研究对象为水稻胚乳文库及其生物信息数据库和自嘉兴市农科院采集的274个不同水稻品种胚乳总RNA制成的RNA阵列及测定的样品直链淀粉含量数据库。 1.对前期构建的水稻胚乳cDNA文库进行生物信息学分析,获得14类胚乳文库高丰度的表达基因,主要是与贮藏蛋白、淀粉的生物合成、光合作用及品质等相关基因。其中发现14个本文库特有基因:如谷蛋白C、10 kDa醇溶谷蛋白前体、11S球蛋白及12S种子储藏球蛋白前体等。也检测到部分抗性相关基因如几丁质酶基因。 2.利用Cyber-T对灌浆期胚乳与茎、叶、穗轴、胚乳和胚4个水稻组织的cDNA阵列杂交结果进行差异比较,结果显示2大类基因在胚乳中特异上调表达:品质相关基因和防御基因。品质相关基因有贮藏蛋白类、过敏蛋白类和含硒蛋白、锰有效性相关蛋白。种子过敏蛋白和Bet v Ⅰ allergen-like蛋白在胚乳中高表达;而主要的花粉过敏原Bet v 1-L和β-棒曲霉素1a前体基因在胚中上调表达。抗性相关基因有Thaumatin、过氧化物酶、PR-5、LTP 5、受体蛋白激酶基因、RAB24;水稻防卫相关基因有衰老相关基因和干旱相关蛋白等。另外,胚中上调表达的防御相关基因有金属硫因蛋白、热激蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制剂-Ⅰ。胚乳和胚分别与其他四个组织相比较后得到的胚乳特异高表达基因共51个,胚特异高表达基因6个。已知胚乳特异高表达基因主要是贮藏蛋白、核糖体蛋白、种子过敏蛋白RA14和代谢相关基因、淀粉合成酶Ⅰ（GBSS Ⅰ）和类Constans蛋白基因等。已知胚特异高表达基因是劳氏紫基因和16kDa油脂蛋白基因。其后的RNA阵列进一步验证了cDNA阵列的检测结果。 3.以过敏蛋白基因、油脂蛋白、富硒蛋白、淀粉相关基因四类胚乳中特异高表达的品质相关基因共8个基因的cDNA克隆为探针与274种不同水稻胚乳RNA制备的RNA阵列杂交,探索品质相关基因表达谱差异,以期从中筛选优质水稻品系。结果显示,这些基因间表达差异性较小,且趋势不同。3个淀粉相关基因中H117E12和H073F05表达模式相近,它们都与Wx非成熟转录本表达趋势较远。种子过敏蛋白（H147A06）与其它两个过敏蛋白基因表达模式相距较远,其它两个过敏基因表达模式却很近。从8个基因的表达谱来看,过敏蛋白、富硒蛋白和油脂蛋白基因表达在一半以上的品种中较弱,而其中的种子过敏蛋白基因在多数水稻品种中表达较强。籼稻中Wx基因的成熟转录本表达较强,而在粳稻中表达则较弱;相比之下,Wx基因非成熟转录本表达特征不是很明显。 4.筛选出AC值符合国家优质水稻品系标准,在三类过敏蛋白中表达较低,且在油脂蛋白和富硒蛋白中表达较高的品种共20个。其中,籼稻有3k4,2c25;粳稻有dank3等13种;粳糯品种有:dangao2等5种。为筛选多个指标的优质水稻品系提供一种研究手段。 5.Wxa和Wxb在水稻中表达情况主要有3种:一是,只有Wxa起作用。二是,Wxa起主要作用,Wxb作用较小。三是Wxb起作用,Wxa作用较小。AC的基因效应主要由Wxa决定,Wxb是造成中、低直链淀粉含量品种直链淀粉含量降低的原因之一。而在糯稻中AC低的原因是由其它碱基突变造成的。发现不仅Wx与AC存在着一定相关性,而且sbeⅠ与AC之间存在一定相关性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 稻米品质和影响因素及其分子生物学研究
• 1 稻米的品质标准
• 2 稻米的组织结构和化学组成及其与品质的关系
• 2.1 稻米组织结构及其与品质的关系
• 2.2 稻米化学组成及其与品质的关系
• 2.3 品种和遗传对稻米品质的影响
• 3 稻米品质的影响因素
• 3.1 土壤水分对稻米品质的影响
• 3.2 氮肥对稻米品质的影响
• 3.3 温光因子对稻米品质影响的研究进展
• 4 稻米品质的分子生物学研究
• 4.1 稻米品质性状的分子标记QTLs定位
• 4.2 稻米品质相关基因的克隆、分子特性及其表达调控的研究
• 4.2.1 与淀粉合成相关的酶基因
• 4.2.1.1 颗粒结合淀粉合成酶基因（Wx）
• 4.2.1.2 可溶性淀粉合成酶基因（SSS）
• 4.2.1.3 淀粉分支酶基因（RBE基因）
• 4.2.1.4 淀粉去分支酶基因（DBE基因）
• 4.2.2 控制水稻蛋白质含量的基因
• 4.2.2.1 醇溶蛋白基因
• 4.2.2.2 谷蛋白基因
• 4.3 转基因技术改良稻米品质的研究
• 4.3.1 转基因技术改良稻米蒸煮食味品质
• 4.3.2 转基因技术改良稻米营养品质
• 4.3.3 转基因技术培育功能性水稻品种
• 4.4 存在问题及解决措施
• 参考文献
• 第二部分 研究报告
• 第二章 水稻胚乳特异性基因表达谱分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 水稻胚乳cDNA芯片杂交及数据分析
• 1.2.1 cDNA微阵列制备
• 1.2.2 分子杂交
• 1.2.3 cDNA芯片杂交数据提取与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 cDNA芯片重复性检验
• 2.2 分别与胚乳和胚有差异表达的基因分析
• 2.2.1 胚乳中上调表达的稻米品质相关基因
• 2.2.2 胚乳和胚中高表达的防御基因表达谱
• 2.3 胚乳和胚中特异高表达基因的鉴定
• 3 小结
• 第三章 胚乳特异性品质相关基因的表达谱分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 酶及主要试剂
• 1.3 65℃沸水结合反复冻融法提取水稻胚乳总RNA具体步骤
• 1.4 RNA阵列探针制备与标记
• 1.5 RNA阵列制备及数据分析
• 1.5.1 RNA阵列制备
• 1.5.2 RNA阵列杂交及数据提取与分析
• 2 结果及分析
• 2.1 利用65度沸水加热结合反复冻融法抽提274个水稻样本的胚乳总RNA
• 2.2 水稻品质相关基因与优质水稻品系间的相关性
• 2.2.1 富硒蛋白（selenoprotein）
• 2.2.2 过敏性蛋白基因类（allergic proteins）
• 2.2.3 油脂蛋白（oleosin）
• 2.3 RNA阵列结果分析并检测优良水稻品系
• 2.3.1 274个样本在品质相关基因中的表达谱差异分析
• 2.3.2 结合RNA阵列分析结果检测多个指标下的优质水稻品系
• 2.3.3 8个cDNA探针在RNA阵列中的表达谱差异分析
• 3 小结
• 第四章 大规模样本在淀粉相关基因与直链淀粉之间的相关性鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 酶及主要试剂
• 1.3 直链淀粉含量的测定
• 1.4 提取水稻胚乳总RNA步骤
• 1.5 RNA阵列制备
• 1.6 探针的制备和标记
• 1.7 数据分析
• 2 结果及分析
• 2.1 AC数据的确定
• 2.2 RNA阵列均一性分析
• 2.3 Wx、sbeI基因与AC值的相关性分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 致谢