论文摘要
柑橘木虱（Diaphorina citri Kuwayama）可通过传播黄龙病给柑橘产业造成巨大损失。了解柑橘木虱内生菌群落组成和影响因素,可为研究木虱内生菌与黄龙病菌在虫体内的互作关系,探索防治柑橘黄龙病新途径提供参考。本文结合细菌分离培养和分子生物学方法,研究柑橘木虱内生细菌群落结构及其与寄主不同部位内生菌群落的相似性。此外,采用实时荧光定量PCR技术测定不同龄期、不同温度对木虱内生细菌Syncytium endosymbiont（合胞体共生菌）和Wolbachieae endosymbiont（沃尔巴克氏体共生菌）含量的影响。主要有以下研究结果：参考3种昆虫DNA提取方法和试剂盒法提取木虱内生菌DNA,并用细菌16S rDNA通用引物进行扩增,结果显示,所参考的3种昆虫DNA提取方法得到的总DNA完整性较低,PCR扩增需要进一步摸索。FastDNA试剂盒法提取的总DNA纯度和完整性较高,浓度相对较低,但是浓度为12-15 ng/μL,1μL就可以得到很好的扩增效果。PCR扩增产物可以很好的进行克隆测序。所以试剂盒法提取木虱内生菌总DNA较合适。利用试剂盒提取木虱内生细菌DNA,通过分子生物学技术以16S rDNA基因为基础对柑橘木虱成虫内生细菌群落结构进行研究。对随机挑取的100个克隆子进行测序比对和系统发育树分析后,结果显示所克隆的序列可分成8个组。第一组含34个克隆子,所克隆序列与柑橘木虱体内合胞体共生菌（Syncytium endosymbiont） 16S rDNA序列（Accession no.AB038368）的相似性为99-100%。第二组为柑橘木虱体内Carsonella ruddii （Accession no.AB038367） （16S rDNA相似性为99%）,仅含1个克隆子,与第一组的相似性为80-86%。第三组含克隆子1个,所克隆序列与柑橘木虱沃尔巴克氏体共生菌Wolbachia sp. （endosymbiont）的16S rDNA序列（Accession no. EF433793）相似性为100%。第四组,16个克隆子,它们与褐飞虱沃尔巴克氏族共生菌（Wolbachieae endosymbiont） （Accession no.GU124506）的16S rDNA相似性为100%；与第三组序列的相似性为98-99%。第五组15个克隆子,与柑橘木虱另一种沃尔巴克氏体共生菌Wolbachia sp. （endosymbiont）的16S rDNA （Accession no. EU914940）相似性为99-100%,与第三、第四组的相似性为34-35%。第六组含1个克隆子,其序列与其余99个克隆子的序列相似性为32-91%,在GenBank里与其同源性最高的序列为柑橘木虱Wolbachia sp.（endosymbiont）的16S rDNA片段（EU914940）,相似性91%。第七组含1个克隆子,是Uncultured Pantoea sp. In soil samples （Accession no.AY942953）（一种不可培养的泛菌）,其序列与其它99个克隆子目标序列的相似性为32-82%。第八组含31个克隆子,与柑橘木虱的Secondary synbiont （Accession no.EU570830）（柑橘木虱次生内共生菌）的同源性为99-100%。正交试验L9（34）筛选结果表明,TSB培养基（pH值7.0）添加柞蚕蛹血淋巴可以分离出较多的柑橘木虱可培养性内生细菌。根据菌落形态的差异,将正交试验中分离到的柑橘木虱内生细菌进行初步分类；通过纯化培养,提取细菌DNA进行16S rDNA鉴定；再通过生理生化特征测定,对鉴定结果进行验证。经鉴定,柑橘木虱可培养性内生菌有：木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、葡萄球菌属（.Staphylococcus sp.）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、肠杆菌属（Enterobacter sp.）、短小杆菌属的Curtobacterium oceanosedimentum、砖红色微杆菌（Microbacterium testacyeum）、嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、柠檬色短小杆菌（Curtobacterium citreum）。对柑橘木虱体内含量较高的Syncytium endosymbiont（合胞体共生菌）和Wolbachia sp. （endosymbiont）（沃尔巴克氏体共生菌）构建的标准曲线判定系数分别达到0.998和0.996,回归方程分别为Ct=-3.2530 x log （conc）+34.960和Ct=-3.2077 x log （conc）+36.206.在木虱体内,Syncytium endosymbiont和Wolbachia endosymbiont平均含量在成虫与若虫之间存在显著差异。Syncytium endosymbiont含量高温（35 oC）处理显著性增加。Wolbachia sp.（endosymbiont）在成虫（同一龄期）体内高温（350C）处理1d显著减少,3d、5d后显著性增加。利用优化后TSB培养基对12个随机选取的柑橘品种的不同部位的内生细菌以及其上面的五龄木虱内生细菌进行分离鉴定,分析其相似系数。结果表明,柑橘木虱体可培养.性内细菌较少,其中Curtobacterium flaccumfaciens（萎蔫短小杆菌）、Bacillus aryabhattai、 Bacillus licheniformis（地衣芽胞杆菌）在寄主植物根、茎、叶内部及根区土壤中均存在,且数量较多。在不同柑橘品种间,柑橘木虱的内生菌群落相似系数（0.3848）显著高于它与茎、根部内生菌群落和土壤微生物群落的相似系数。柑橘叶片内生菌群落在不同品种间的稳定性也较高,其相似性系数为0.353。不同柑橘品种间,土壤细菌群落的相似数较低,它与其它部们细菌群落的相似系数也较其它群落间的低。柑橘木虱内生菌群落分别与寄主叶、茎、根、土壤细菌群落的相似系数之间不存在显著的差异。