药物中间体环氧化物的微生物法去消旋化的研究

论文摘要

(S)-苯基环氧乙烷是重要的手性药物中间体,在抗癌药与驱虫药levamisole等的合成上具有重要的应用价值,微生物酶法拆分外消旋苯基环氧乙烷生产（S）-苯基环氧乙烷具有良好的应用前景。以外消旋苯基环氧乙烷为唯一碳源,从土壤分离得到了200余株能在选择性平板上生长的菌株,经变色酸显色法从中筛选得到了53株具有环氧化物水解酶活性的菌株。利用液相色谱分析确定其中的18株有较高的环氧化物水解酶活性,手性液相色谱分析筛选得到能立体选择性水解外消旋苯基环氧乙烷得到（S）-苯基环氧乙烷的菌株G7,转化产物e.e值达到99.3%。提取菌株G716S rDNA,采用通用引物进行PCR扩增,测定16SrDNA序列,所测序列经GenBank比对分析,确定菌株G7为Bacillus subtilis,同源性99%。对菌株G7发酵培养基的碳源、氮源、无机金属离子、初始pH值、培养时间等进行了研究。结果表明,培养基成分为蔗糖10g/L,胰蛋白胨10g/L,Na2HPO4·12H2O2g/L, KH2PO42g/L, MgSO4·7H2O0.25g/L, CaCl20.11g/L, pH6.5,30℃培养25h,G7酶活力达到最高值372.2U/mg。对菌株G7转化苯基环氧乙烷的缓冲液pH值、转化时间、底物浓度、温度等进行研究。结果表明,底物质量浓度为10mg/ml,温度为30℃C,缓冲液pH为7.0时,转化20h,底物转化率最高达49.3%,可获得e.e值最高达99.5%的产物（S）-苯基环氧乙烷。

论文目录

• 学位论文数据集
• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 手性化合物与手性技术
• 1.1.1 手性药物
• 1.1.2 手性化合物的常规制备方法
• 1.1.2.1 手性源
• 1.1.2.2 消旋体的物理与化学法拆分
• 1.1.2.3 不对称合成
• 1.1.3 生物催化不对称合成
• 1.1.3.1 生物催化
• 1.1.3.2 生物催化手性化合物拆分
• 1.1.3.3 用于选择性生物催化的微生物
• 1.1.3.4 生物催化不对称合成的展望
• 1.2 环氧化物水解酶
• 1.2.1 环氧化物水解酶作用机理
• 1.2.2 环氧化物水解酶的分布
• 1.2.2.1 哺乳动物来源环氧化物水解酶
• 1.2.2.2 微生物来源环氧化物水解酶
• 1.2.3 环氧化物水解酶的研究进展
• 1.3 课题研究意义及内容
• 第二章 菌种初筛
• 2.1 引言
• 2.2 初筛方案的确定
• 2.3 材料与方法
• 2.3.1 试剂
• 2.3.2 主要仪器
• 2.3.3 培养基
• 2.3.3.1 筛选培养基
• 2.3.3.2 菌种保存培养基
• 2.3.3.3 发酵培养基
• 2.3.4 实验方法
• 2.3.4.1 土壤中菌株的筛选
• 2.3.4.2 菌株的培养
• 2.3.4.3 完整细胞转化苯基环氧乙烷
• 2.3.4.4 变色酸显色法测定转化率
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 土壤中菌株的筛选
• 2.4.2 苯乙二醇标准曲线的绘制
• 2.4.3 菌株完整细胞转化苯基环氧乙烷结果
• 2.5 小结
• 第三章 菌种复筛
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.3.1 菌种保存培养基
• 3.2.3.2 发酵培养基
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.4.1 菌株的液体培养与预处理
• 3.2.4.2 菌株完整细胞转化苯基环氧乙烷
• 3.2.4.3 检测波长的确定
• 3.2.4.4 HPLC法测定转化率
• 3.2.4.5 手性HPLC测定e.e值
• 3.2.4.6 菌株的鉴定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 HPLC法确定各筛选出的菌株的转化率
• 3.3.2 菌株的选定
• 3.3.3 菌株G7的鉴定
• 3.3.3.1 菌株G7 16S rDNA的提取、扩增
• 3.3.3.2 菌株G7 16S rDNA的序列比对结果
• 3.4 小结
• 第四章 菌株G7的发酵条件研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 培养基
• 4.2.3.1 菌种保存培养基
• 4.2.3.2 发酵培养基
• 4.2.4 实验方法
• 4.2.4.1 菌株G7的液体培养与预处理
• 4.2.4.2 菌株完整细胞转化与酶活力的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 碳源对菌株G7环氧化物水解酶活力的影响
• 4.3.2 氮源对菌株G7环氧化物水解酶活力的影响
• 4.3.3 蔗糖浓度对菌株G7环氧化物水解酶活力的影响
• 4.3.4 胰蛋白胨浓度对菌株G7环氧化物水解酶活力的影响
• 4.3.5 无机金属离子对菌株G7环氧化物水解酶活力的影响
• 4.3.6 初始pH值对菌株G7环氧化物水解酶活力的影响
• 4.3.7 培养温度对菌株G7环氧化物水解酶活力的影响
• 4.3.8 培养时间对菌株G7环氧化物水解酶活力的影响
• 4.4 小结
• 第五章 菌株G7转化苯基环氧乙烷条件的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 培养基
• 5.2.3.1 菌种保存培养基
• 5.2.3.2 发酵培养基
• 5.2.4 实验方法
• 5.2.4.1 菌株G7的液体培养与预处理
• 5.2.4.2 菌株G7完整细胞转化
• 5.2.4.3 HPLC法测定底物转化率与转化产物e.e值
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 底物浓度对转化的影响
• 5.3.2 缓冲液pH值对转化的影响
• 5.3.3 温度对转化的影响
• 5.3.4 时间对转化的影响
• 5.4 小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 附件