HBV自身表达miRNA的验证及功能初探和HBV对肝癌细胞系miRNA表达谱的影响分析

论文摘要

乙肝病毒（HBV）是已知感染人类的最小DNA病毒,是病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌（HCC）等疾病的主要致病因素之一,迄今没有根除其感染的方法,而对其致病机理的研究将有助于其感染的根除。miRNA是一类长约-22nt,内源性,具有重要调控功能的非编码RNA。已有研究发现,许多DNA病毒可以表达miRNA,且其自身表达的miRNA能够与宿主基因相互作用,促进病毒持续感染。本课题的第一部分是HBV自身表达miRNA的鉴定和功能研究。我们发现HBV基因组一些区域能形成茎环结构,该结构是表达miRNA的必要条件。此后通过对]HepG2.2.15细胞（能分泌HBV病毒颗粒）小RNA进行高通量测序,我们发现了一个HBV自身表达的miRNA（命名为hbv-miR-BCP）。后续的实验进一步验证了hbv-miR-BCP在HepG2.2.15中的表达。根据成熟的hbv-miR-BCP序列,我们采用miRanda软件,预测得到3种在与清除病毒感染相关的宿主细胞通路中的候选靶基因——TRADD、ULBP2、ULBP3,经荧光素酶实验验证TRADD可能是hbv-miR-BCP的靶基因。这些结果为后续研究HBV miRNA的功能及HBV的致病机理提供了基础。第二部分研究内容为HBV对肝癌细胞系入源miRNA表达谱的影响。已知miRNA的表达具有发育阶段和组织细胞特异性,课题组对两种同源的HCC细胞系---HepG2和]HepG2.2.15的小RNA进行高通量测序发现,它们之间人源miRNA的表达谱存在很大差异。为了验证测序结果,我们采用qRT-PCR方法证实了10种在两个细胞系中差异极其显著的miRNA。由于已有研究发现HBV X蛋白（HBx）具有转录调控作用,我们推测该蛋白可能会影响人源miRNA的表达。为此,我们在]HepG2中高表达HBx,采用qRT-PCR对测序发现的10种差异表达miRNA的表达谱进行检测,与对照细胞相比,其中5种miRNA的表达发生了显著差异。对这些差异表达miRNA的研究,有助于进一步揭示HCC发生发展的分子机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 ：综述
• 一、引言
• 二、乙型肝炎病毒基因组结构
• 三、miRNA及其产生机制
• 3.1 miRNA简介
• 3.2 miRNA编码基因及其产生机制
• 四、miRNA的作用机制
• 4.1 RISC及其成分
• 4.2 miRNA抑制靶基因表达的作用方式
• 五、病毒自身表达miRNA的发现及功能
• 5.1 病毒自身表达miRNA的发现
• 5.2 病毒miRNA的功能
• 六、miRNA的表达特性
• 七、miRNA的功能及其与肿瘤发生发展的关系
• 7.1 miRNA的功能涉及生物体通路的多个方面
• 7.2 miRNA作为tumor suppressor或cancer inducer发挥作用
• 八、miRNA在HCC的发生发展中具有重要作用
• 第二章 ： HBV自身表达miRNA的验证及功能研究和HBV对肝癌细胞系miRNA表达谱的影响
• 一、引言
• 1.1 HBV基因组具有表达自身miRNA的序列特征
• 1.2 HBV可能影响肝癌细胞系人源miRNA表达谱
• 1.3 研究思路
• 二、材料和方法
• 2.1 主要实验材料
• 2.1.1 细胞系
• 2.1.2 各种功能载体
• 2.1.3 主要试剂/试剂盒
• 2.1.4 其他实验材料
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 小RNA SOLiD高通量测序
• 2.2.2 Northern Blotting验证hbv-miR-BCP的表达
• 2.2.3 克隆测序鉴定hbv-miR-BCP的表达
• 2.2.4 软件预测miRNA靶基因
• 2.2.5 重组质粒的构建
• 2.2.6 细胞转染
• 2.2.7 双荧光素酶报告系统信号检测与统计处理
• 2.2.8 qRT-PCR验证人源miRNA表达谱
• 2.2.9 半定量PCR和Westem Blotting检测HepG2中HBx的表达
• 三、 结果分析与讨论1——HBV自身表达miRNA的验证和功能研究
• 3.1 结果与分析
• 3.1.1 SOLiD测序发现一个由HBVBCP区表达的miRNA—hbv-miR-BCP
• 3.1.2 Northern Blotting证实hbv-miR-BCP的表达
• 3.1.3 克隆测序验证hbv-miR-BCP的表达
• 3.1.4 miRanda预测得到3个hbv-miR-BCP的候选靶基因
• 3.1.5 成功优化三种质粒共同转染体系
• 3.1.6 TRADD可能为hbv-miR-BCP的靶基因
• 3.2 讨论
• 3.2.1 克隆测序中上游引物的设计
• 3.2.2 hbv-miR-BCP序列3’端游离不定
• 3.2.3 靶基因预测范围设计
• 3.2.4 hbv-miR-BCP靶基因与病毒在宿主体内感染与存活的关系
• 四、 结果分析与讨论2——HBV对肝癌细胞系人源miRNA表达谱的影响分析
• 4.1 结果与分析
• 4.1.1 SOLiD测序得到多种差异表达的人源miRNA
• 4.1.2 qRT-PCR验证了10种差异表达的人源miRNA
• 4.1.3 差异表达的人源miRNA对HCC发展起到一定作用
• 4.1.4 成功构建HBV X基因表达载体
• 4.1.5 RNA半定量显示HBx在HepG2中表达
• 4.1.6 Westem blotting显示HBx在HepG2中存在表达
• 4.1.7 高表达HBx的HepG2细胞中人源miRNA的表达存在差异
• 4.2 讨论
• 4.2.1 在HepG2和HepG2.2.15间差异表达的人源miRNA功能分析
• 4.2.2 HBV X蛋白影响HepG2.2.15中人源miRNA表达谱的可能性分析
• 五、结论
• 5.1 HBV能够表达自身miRNA—-hbv-miR-BCP,并初步鉴定TRADD可能为其的靶基因
• 5.2 HBV的存在可影响肝癌细胞系中多种人源miRNA的表达
• 附表
• 参考文献
• 致谢