一个新的人类睾丸特异性基因-TDRG1的cDNA克隆及表达分析

论文摘要

越来越多的研究表明，生精障碍是导致男性不育的重要因素之一。精子生成是一个复杂的细胞发育与分化的过程，受一个由多个基因参与的基因网络的高度调控，这些基因可能既存在性染色体上，也存在常染色体上。分离生精相关基因是男性不育研究中的一个重要课题，研究和发现这些基因，对于阐明精子发生的机制具有重要的生理和病理学意义。 本课题运用了一种发现人类新基因的新策略“数据库消减杂交”（Digital Differential Display，DDD）——即通过计算机对不同文库进行比较来发现在统计学意义上存在明显转录差异基因的定量分析方法，结合RT-PCR、Northern杂交等实验验证成功克隆了一个人类睾丸组织特异性表达的新基因，并探讨了其与精子发生的关系。本研究分为2个部分，其主要实验方法及实验结果如下： 第一部分：数据库消减杂交方法克隆人类睾丸组织特异性表达新基因TDRG1 1 新基因的电子克隆 美国NCBI的Unigene数据库中拥有大量的表达序列标签（EST），它们来源于不同组织、不同细胞、不同病理状态下所构建的cDNA文库，已成为人们寻找新基因的重要标志物。Digital DifferentialDisplay（DDD）是一种利用Unigene数据库中的ESTs进行数种平行材料之间的比较的方法。运用该方法，我们进行了两种平行材料之间的比较：挑选9个人类睾丸组织来源的cDNA序列文库作为检测子，并将之归为pool A；将76个人类其他组织或细胞株来源的cDNA文库序列作为驱赶子，并将之归为pool B；通过pool A：pool B之间的比值来计算倍数差异，并以≥10倍的差异为筛选标准，经数据库杂交筛选获得在统计学意义上存在差异显示的克隆重叠群。 在获得的29个全新克隆重叠群中，Hs.180197是其中一个其差异表达最显著的克隆重叠群，生物信息学分析显示其代表一个新基因，我们将之作为本课题的研究重点。Hs．180197包括3个EST，运用EST拼接工具进行序列匹配、整合，获得了一个新的未知序列contig1。将contig1与EST Human数据库比较，发现该序列包含另

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 新基因的克隆
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 人睾丸组织总RNA的抽提
• 1.4 数据库消减杂交
• 1.5 设计PCR引物以扩增新基因阅读框全长
• 1.6 新基因完整编码区的cDNA克隆
• 1.7 大肠杆菌感受态的制备
• 1.8 新基因阅读框全长PCR产物连接转化
• 1.9 阳性克隆的确定
• 1.10 PUCm-T／新基因重组质粒DNA的提取
• 2 结果
• 2.1 新基因序列分析
• 2.2 新基因完整编码区的cDNA克隆
• 3 讨论
• 第三章 新基因在人多种组织RT-PCR分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 人各组织总RNA的抽提
• 1.4 开放阅读框全长引物
• 1.5 RNA样品的浓度测定及质量鉴定
• 1.6 PCR扩增
• 2 结果
• 3 讨论
• 第四章 新基因多组织Northern杂交分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 人各种组织RNA的抽提
• 1.4 RNA样品的浓度测定及质量鉴定
• 1.5 Northern膜的制备
• 1.6 大肠杆菌感受态的制备
• 1.7 PUCm-T／新基因重组质粒DNA的提取
• 1.8 Northern杂交检测新基因的组织表达谱
• 2 结果
• 3 讨论
• 第五章 新基因序列和蛋白质结构的生物信息学分析
• 1 材料和方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 TDRG1基因的染色体定位
• 1.3 酶切位点分析
• 1.4 蛋白理化性质分析
• 1.5 跨膜区分析
• 1.6 信号肽分析
• 1.7 蛋白细胞内定位预测
• 1.8 蛋白基序分析
• 1.9 核酸和蛋白序列及空间结构相似性比较和结构功能域分析
• 2 结果
• 2.1 染色体定位
• 2.2 酶切位点分析
• 2.3 蛋白质性质分析
• 2.4 蛋白质一级结构分析
• 3 讨论
• 第六章 TDRG1基因功能的初步研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 人睾丸组织总RNA的抽提
• 1.4 TDRG1基因PCR引物及原位杂交探针
• 1.5 RNA样品的浓度测定及质量鉴定
• 1.6 不同发育时期人睾丸组织RT-PCR扩增TDRG1阅读框片断
• 1.7 睾丸组织的多聚甲醛固定和石蜡包埋
• 1.8 组织石蜡切片的制备
• 1.9 不同发育时期人睾丸组织切片原位杂交检测TDRG1基因表达
• 2 结果
• 2.1 不同发育时期人睾丸组织RT-PCR
• 2.2 原位杂交
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果