苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的C-半段对Vip3Aa7和Cry7Ba1蛋白包含体形成的影响

论文摘要

本论文利用苏云金芽胞杆菌的表达调控元件及来自Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白和晶体形成,蛋白稳定相关的C-半段,辅助蛋白p20等研究对营养期杀虫蛋白Vip3Aa7,杀虫晶体蛋白Cry2Aa,Cry3Aa晶体形成,表达量和杀虫活性的影响,建立了一个苏云金芽胞杆菌高效表达体系;并通过Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白的N-、C-半段互换,研究了苏云金芽胞杆菌Cry1类杀虫晶体蛋白的C-半段对Cry7Ba1晶体蛋白溶解性,晶体形成及毒性的影响,主要结果如下:1.苏云金芽胞杆菌C-半段使Vip3Aa7形成包含体并且显著提高其表达量本文利用苏云金芽胞杆菌ICPs蛋白的各种表达调控元件,希望提高营养期杀虫蛋白Vip3Aa7的表达量,改善其因为分泌到胞外给生产应用带来的不便,研究芽胞依赖型BtⅠ-BtⅡ启动子,上游调控区,终止子及大分子杀虫晶体蛋白C-半段对Vip3Aa7表达量和包含体形成的影响,结果表明:1.1 Cry1C的C-半段不仅显著提高了Vip3Aa7融合蛋白的表达量,重组蛋白的表达量比出发菌株的表达量高9.3倍,而且使其形成包含体。1.2 Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白的C-半段与Cry1C的的C-半段具有同样的功能,均能显著提高Vip3Aa7融合蛋白的表达量,重组蛋白的表达量比出发菌株的表达量分别高9.4和9.0倍,而且也能使其形成包含体。1.3生物测定结果表明,重组蛋白的杀虫毒力与出发菌株的蛋白相比普遍降低了。本实验首次报道Cry1C晶体蛋白的C-半段能使Vip3Aa7蛋白以包含体的形式存在,并且显著提高其表达量,这为Vip3Aa7蛋白以芽胞制剂的形式在生产中应用奠定了相应的理论基础,具有非常重要的理论实践意义。2.辅助蛋白p20提高Vip3Aa7融合蛋白表达的表达量将来自以色列亚种的辅助蛋白p20构建到另一穿梭载体pBE2上,与上文构建的重组质粒共转构建了一系列工程菌,发现辅助蛋白p20对以上Vip3Aa7融合蛋白表达量均有提高,几个融合蛋白在晶体形成上没有明显不同,而且p20并不影响融合蛋白的杀虫活性。说明辅助蛋白p20能提高Vip3Aa7融合蛋白的表达量。3.Cry1类蛋白的C-半段显著提高Cry2Aa和Cry3Aa蛋白的表达量将Cry1C和Cry1Ac的C-半段分别与Cry2Aa和Cry3Aa的毒力核心区融合在一起,构建融合基因,结果表明Cry1C和Cry1Ac的C-半段使不含C-半段的Cry2Aa和Cry3Aa的蛋白表达量显著提高,但仍然不能使Cry2Aa和Cry3Aa形成规则晶体,只能形成无规则形状的包含体,重组蛋白杀虫毒力与出发蛋白相比没有显著变化,说明本文建立的超量表达系统不含C-半段的苏云金芽胞杆菌的表达量也能显著,并且不影响重组蛋白的功能和活性。4.4.Cry1类蛋白的C-半段提高了Cry7Ba1蛋白的溶解性并且恢复了其毒力Cry7Ba1杀虫晶体蛋白只有在pH＞11.5的碱性溶液中才能溶解,并且晶体蛋白只有在体外溶解后才对小菜蛾表现出一定毒性,这极大影响了其在实际生产中的应用,本实验将Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1的N-、C-半段互换,研究较易溶解的苏云金芽胞杆菌Cry1类的C-半段对Cry7Ba1蛋白溶解性的影响。结果表明:Cry7Ba1的难溶性是由其C-半段决定,其毒性由N-半段决定。通过替换C-半段提高了cry7Ba1晶体蛋白的溶解性从而恢复了其毒力,为解决这一类由于溶解性的丧失导致毒性丧失的苏云金芽胞杆菌的生产应用打开了一个新的思路,在理论和应用上均具重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviations）
• 1 文献综述
• 1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的分类
• 1.1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的多样性
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构与功能
• 1.2.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的一级结构与功能
• 1.2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的空间结构与功能
• 1.2.2.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的空间结构
• 1.2.2.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白结构域的功能
• 1.3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的表达与调控
• 1.3.1 转录水平的调控
• 1.3.1.1 依赖芽胞形成的杀虫晶体蛋白基因的转录调控
• 1.3.1.2 非依赖于芽胞形成的杀虫晶体蛋白基因的转录调控
• 1.3.1.3 启动子及上游区和σ因子与转录调控
• 1.3.2 转录后水平的调控
• 1.3.2.1 mRNA 3′末端的终止子结构
• 1.3.2.2 mRNA 5′末端的稳定子
• 1.3.3 翻译水平的调控
• 1.3.4 翻译后水平的调控
• 1.3.4.1 伴胞晶体的形成
• 1.4 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的抗性以及防治措施
• 1.5 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白
• 1.5.1 营养期杀虫蛋白类型及其杀虫机理
• 1.5.1.1 Vip1和Vip2及其作用机理
• 1.5.1.2 Vip3蛋白及其作用机理
• 1.5.2 营养期杀虫蛋白的应用
• 1.5.2.1 转vip基因植物
• 1.5.2.2 构建vip融合基因
• 1.6 "无毒"晶体蛋白及Cry7Ba1杀虫晶体蛋白的简介
• 1.6.1 "无毒"晶体蛋白简介
• 1.6.2 Cry7Ba1杀虫晶体蛋白的简介
• 1.6.3 晶体蛋白溶解性与杀虫活性的关系
• 1.6.4 杀虫晶体蛋白的结构化学及其杀虫特性
• 1.7 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 细菌用抗生素及其培养温度
• 2.1.4 试剂与器材
• 2.1.4.1 试剂
• 2.1.4.2 仪器
• 2.1.5 供试昆虫
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA操作
• 2.2.1.1 苏云金芽胞杆菌质粒的制备
• 2.2.1.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
• 2.2.1.3 质粒DNA的纯化
• 2.2.1.4 DNA的体外重组操作
• 2.2.2 重组质粒的转化及转化子的筛选鉴定
• 2.2.2.1 大肠杆菌的常规转化
• 2.2.2.2 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 2.2.2.3 大肠杆菌转化子的筛选
• 2.2.2.4 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选
• 2.2.3 蛋白的SDS-PAGE及其定量
• 2.2.3.1 晶体蛋白SDS-PAGE样品的制备
• 2.2.3.2 营养期杀虫蛋白样品的制备
• 2.2.3.3 SDS-PAGE凝胶的制备
• 2.2.3.4 电泳、染色及脱色
• 2.2.3.5 蛋白的密度定量
• 2.2.3.6 生测用晶体蛋白溶液的制备
• 2.2.4 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体显微镜观察
• 2.2.5 毒力的生物测定
• 2.2.6 PCR扩增
• 2.2.6.1 引物序列
• 2.2.6.2 DNA的PCR扩增
• 3 结果与分析
• 3.1 杀虫晶体蛋白C-半段使Vip3Aa7蛋白以包含体的形式大量表达
• 3.1.1 Cry1C的C-半段使Vip3Aa7蛋白以包含体的形式大量表达
• 3.1.1.1 cry1C的BtⅠ-BtⅡ启动子和终止子对Vip3Aa7蛋白表达的影响
• 3.1.1.2 Cry1C的DomainⅢ和C-半段使Vip3Aa7蛋白以包含体的形式大量表达
• 3.1.1.3 cry1C的启动子上游调控区提高了Vip3Aa7蛋白的表达量
• 3.1.1.4 Cry1C的C-半段显著提高了Vip3Aa7蛋白的表达量
• 3.1.2 Cry1Ac的C-半段使Vip3Aa7蛋白以包含体的形式大量表达
• 3.1.2.1 含Cry1Ac的C-半段编码区及vip3Aa7-s重组质粒pBMB0173的构建
• 3.1.2.2 Cry1Ac的C-半段显著提高了Vip3Aa7蛋白的表达量使其形成包含体
• 3.1.3 Cry7Ba1的C-半段使Vip3Aa7蛋白以包含体的形式大量表达
• 3.1.3.1 含Cry7Ba1的C-半段编码区及vip3Aa7-s重组质粒pBMB0187的构建
• 3.1.3.2 Cry7Ba1的C-半段对Vip3Aa7表达量、包含体形成和毒性的的影响
• 3.1.4 辅助蛋白p20提高了Vip3Aa7蛋白的表达量
• 3.1.4.1 含辅助蛋白p20的重组质粒pBMB0177的构建
• 3.1.4.2 含辅助蛋白p20的重组菌的验证
• 3.1.4.3 辅助蛋白p20增加了Vip3Aa7蛋白的表达量
• 3.1.4.4 辅助蛋白p20不能使Vip3Aa7形成菱形晶体
• 3.1.4.5 辅助蛋白p20不影响Vip3Aa7的毒性
• 3.2 Cry1的C-半段显著提高了Cry2Aa和Cry3Aa蛋白的表达量
• 3.2.1 Cry1晶体蛋白的C-半段显著提高了Cry2Aa蛋白的表达量
• 3.2.1.1 Cry1C的C-半段显著提高了Cry2Aa蛋白的表达量
• 3.2.1.2 Cry1Ac的C-半段显著提高了Cry2Aa蛋白的表达量
• 3.2.2 Cry1晶体蛋白C-半段显著提高了Cry3Aa蛋白的表达量
• 3.2.2.1 Cry1C的C-半段显著提高了Cry3Aa蛋白的表达量
• 3.2.2.2 Cry1Ac的C-半段显著提高了Cry3Aa蛋白的表达量
• 3.3 Cry1蛋白的N-半段和C-半段对Cry7Ba1蛋白表达的影响
• 3.3.1 Cry1Ac和Cry1C的C-半段对Cry7Ba1蛋白表达的影响
• 3.3.1.1 Cry1Ac和Cry1C的C-半段编码区替换Cry7Ba1的C-半段编码区构建重组质粒pBMB0184和pBMB0185
• 3.3.1.2 Cry1Ac和Cry1C的C-半段提高了Cry7Ba1蛋白的溶解性
• 3.3.1.3 Cry1Ac和Cry1C的C-半段使Cry7Ba1蛋白形成无规则包含体
• 3.3.1.4 Cry1Ac和Cry1C的C-半段不影响Cry7Ba1蛋白的毒性
• 3.3.2 Cry1C和Cry1Ac的N-半段对Cry7Ba1蛋白表达的影响
• 3.3.2.1 Cry1C和Cry1Ac的N-半段编码区替换Cry7Ba1的N-半段编码区构建重组质粒pBMB0181和pBMB0183
• 3.3.2.2 Cry1C和Cry1Ac的N-半段对Cry7Ba1蛋白的溶解性没有影响
• 3.3.2.3 Cry1C和Cry1Ac的N-半段使Cry7Ba1蛋白形成无规则包含体
• 3.3.2.4 Cry1C和Cry1Ac的N-半段决定Cry7Ba1重组蛋白的毒性
• 4 结论与讨论
• 4.1 杀虫晶体蛋白的C-半段使Vip3Aa7蛋白形成包含体并且显著提高蛋白表达量
• 4.2 Cry1蛋白的C-半段提高了Cry2Aa和Cry3Aa蛋白表达的表达量
• 4.3 Cry1的C-半段提高Cry7Ba1蛋白的溶解性并且恢复了其毒性
• 参考文献
• 已发表和待发表的论文
• 致谢