论文摘要
小分子半抗原单克隆抗体制备通常较复杂,且很多情况下,得到的抗体亲和力较差,效价很低,无法满足作为检测性抗体的要求,在很大程度上限制了单克隆抗体的应用。本研究以对硫磷为对象制备了单链抗体,旨在探索已知基因的半抗原基因工程抗体的构建,同时通过基因工程的方法构建了未知抗体基因的抗微囊藻毒素-LR（microcystin-LR, MC-LR）的单链抗体,并在此基础上构建了四价抗体,为基因工程抗体在小分子半抗原类物质检测方面的应用打下基础。参考GenBank中发表的对硫磷抗体序列,对其进行分析后在重链可变区基因（heavy chain V-region, VH）和轻链可变区基因（light chain V-region, VL）之间加上了45个核苷酸作为连接肽序列,由公司合成。构建单链抗体表达载体,经过原核表达得到了可溶性表达的目的蛋白。SDS-PAGE和Western Blot检测表明表达的单链抗体分子量为28 kD。用Ni-NTA金属亲和层析法对可溶性表达产物进行纯化,得到的目的蛋白纯度为74.8%,ELISA检测表明该scFv能够与对硫磷特异性结合。本实验为进一步制备高特异性、高亲和力抗体奠定了基础,并且为基因工程抗体在农药检测方面的应用提供依据。以分泌抗微囊藻毒素MC-LR单克隆抗体的杂交瘤细胞为材料,通过RT-PCR扩增出抗体的重链和轻链全编码区cDNA序列。序列分析表明,PCR得到的抗体重链序列共1473bp,包括部分VH,完整的CH1、CH2、CH3三个恒定区和3’端非编码区,其中VH大小为363bp,编码121个氨基酸,属小鼠IgH-V7183 VH5家族;得到的轻链序列共880bp,包括部分轻链可变区VL,完整的恒定区和3’非编码区,其中VL大小为336bp,编码112个氨基酸,属小鼠IGKV21亚组。VH和VL符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,均含有4个框架区、3个抗原互补决定区及抗体特征性的2个半胱氨酸残基,且基因内无终止密码子,表明得到的序列为小鼠抗体重链和轻链基因序列。分别扩增VH和VL,通过重叠延伸PCR将二者拼接,构建原核表达载体pET-mc。序列分析表明,该scFv基因全长744bp,编码248个氨基酸。将表达载体转化大肠杆菌Origami 2（DE3）进行目的蛋白的诱导表达。经SDS-PAGE和Western Blot分析,单链抗体主要以包涵体的形式在大肠杆菌中表达。在IPTG为0.1 mM,培养温度为15℃时可溶性表达产物含量最高。利用Ni-NTA对可溶性表达产物进行纯化,回收到的目的蛋白浓度为0.115 mg/ml。ELISA检测表明该单链抗体能与MC-LR发生特异性结合。为提高单链抗体的亲和力,利用核心链霉亲和素的四聚化特性对scFv进行多聚化。将scFv基因与核心链霉亲和素基因拼接,并构建四价抗体表达载体pET-teab。经SDS-PAGE和Western Blot分析,四价抗体主要以不溶性的包涵体的形式表达。在IPTG为0.1 mM,培养温度为15℃时可溶性表达产物含量最高。利用Ni-NTA对可溶性表达产物进行纯化,回收到的目的蛋白浓度为0.179 mg/ml。非还原性SDS-PAGE及Western Blot检测表明,回收的目的蛋白以四聚体和单体的形式存在,没有检测到比四聚体分子量大的分子。ELISA检测结果表明,四价抗体与单链抗体和单克隆抗体相比,具有更高的亲和力。