高效生防菌枯草芽胞杆菌的筛选及其发酵工艺优化

论文摘要

在农业生产过程中,植物病原真菌和细菌很易感染植物,每年造成巨大的经济损失。化学农药曾经在植病防治上发挥了巨大的作用,但是它引起土壤、水体和大气的污染,农副产品中农药残留增加,直接危害了人类的健康及生存,以及病原菌的抗药性等问题,由此加速了人们去寻求新的安全有效的植物病害防治途径,生物防治便是其中一种有效的防治途径。本研究以西瓜枯萎尖镰胞菌（Fusarium oxysporum f.sp.melonis）为指示菌,通过NA平板初筛,从实验室保存的482株细菌中得到了17株可以抑制西瓜枯萎尖镰胞菌生长的拮抗菌株,抑菌带宽度达到8.5～26 mm。经过多次传代,保留10株抑菌圈带宽度稳定在10 mm以上的拮抗菌株。同时测得其中BS-3、BS-5、BS-17等菌株对多种植物病原真菌有不同程度的抑制作用。温室盆栽实验表明,BS-3、BS-5、BS-17对西瓜枯萎病的防病效果分别为25.70%、81.77%和41.27%。在湖北省农科院的大田试验重复测定BS-5对西瓜枯萎病的防病效果,发现其防病效果达到了84.58%。由此可见,BS-5对于防治西瓜枯萎病具有良好的效果,有作为生防制剂的潜力。通过形态和生理生化特征初步鉴定菌株BS-5为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）,16S rDNA序列分析进一步确定该菌株为枯草芽胞杆菌。通过硫酸铵分级盐析法对BS-5所产拮抗物质进行了初步提取,发现当硫酸铵饱和度在40%以下时,沉淀物基本无拮抗活性;硫酸铵饱和度在40%～80%之间,基本可以将拮抗物质完全沉淀。在此基础上,初步研究了拮抗粗提物的理化性质。实验结果表明,BS-5拮抗粗提物经100℃处理20 min之后的活性可保存70%以上,121℃处理20 min后的抑菌活性明显下降到35.92%;将拮抗粗提物经氯仿、无水乙醇、乙腈等有机溶剂处理后其抑菌活性基本保持不变;而经紫外线、蛋白酶和高离子强度处理后抑菌活性保持80%以上;在pH 5～8之间活性稳定;BS-5拮抗物质的茚三酮反应呈阴性,酸水解后茚三酮反应呈阳性,双缩脲反应也呈阳性。以金氏培养基为出发培养基,通过摇瓶发酵优化试验,得到BS-5生长的培养基组成和培养条件为:葡萄糖60 g/L,豆粕20 g/L,酵母粉3 g/L,K2HPO4·3H2O1 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L;培养温度30℃,种龄8 h,接种量2%,在500 mL摇瓶中装液量为30 mL,初始pH 7.5,最终生物量达到6.2×109 cfu/mL。在3 L发酵罐中进行BS-5发酵工艺优化,将豆粕浓度提高到40 g/L,此时生物量可以达到8.2×109 cfu/mL;在补糖发酵试验中,初始糖浓度为20 g/L,当葡萄糖浓度低于10 g/L时,补加葡萄糖（每次补加量为20 g/L,共补加两次）,生物量提高到2.8×1010cfu/mL。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 生物防治
• 1.1.1 生物防治的概念
• 1.1.2 生物防治的历史
• 1.2 枯草芽胞杆菌生防机制
• 1.2.1 营养和空间位点的竞争
• 1.2.2 分泌抗菌物质
• 1.2.3 溶菌作用
• 1.2.4 促进植物生长
• 1.3 枯草芽胞杆菌作为生防因子的研究进展
• 1.3.1 国外研究进展
• 1.3.2 国内研究进展
• 1.4 发酵工艺的优化
• 1.4.1 培养基成分对发酵的影响
• 1.4.2 发酵条件优化
• 1.5 研究的目的及意义
• 第二章 生防菌株的筛选及菌种鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 实验仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 菌种活化
• 2.3.2 生防菌的摇瓶培养方法
• 2.3.3 平板初筛实验
• 2.3.4 室内盆栽实验
• 2.3.5 田间实验
• 2.3.6 生防菌BS-5的菌种鉴定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 平板初筛
• 2.4.2 盆栽试验
• 2.4.3 田间实验
• 2.4.4 生防菌BS-5的菌种鉴定结果
• 2.5 小结
• 第三章 生防菌BS-5拮抗物质理化性质的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.3 主要实验仪器
• 3.4 方法
• 3.4.1 BS-5种子液的制备
• 3.4.2 发酵液的制备
• 3.4.3 拮抗物质浓缩液的制备
• 3.4.4 无菌滤液的制备
• 3.4.5 拮抗物质的粗提取
• 3.4.6 拮抗物质对指示菌的抑制作用测定
• 3.4.7 拮抗粗提物理化性质的研究
• 3.5 结果与分析
• 3.5.1 拮抗物质粗分离条件的选择
• 3.5.2 拮抗粗提物理化性质的研究
• 3.6 小结与讨论
• 第四章 生防菌BS-5的摇瓶发酵工艺优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.3 仪器
• 4.4 方法
• 4.4.1 种子液的制备
• 4.4.2 摇瓶培养方法
• 4.4.3 生物量的测定
• 4.4.4 碳源的筛选
• 4.4.5 氮源的筛选
• 4.4.6 碳源和氮源浓度的优化
• 4.4.7 无机盐的筛选
• 4.4.8 无机盐浓度的优化
• 4.4.9 种龄
• 4.4.10 接种量
• 4.4.11 装液量
• 4.4.12 初始pH值
• 4.4.13 温度
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 碳源的筛选
• 4.5.2 氮源的筛选
• 4.5.3 碳源和氮源浓度的优化结果
• 4.5.6 无机盐的筛选
• 4.5.7 无机盐浓度的优化
• 4.5.8 种龄
• 4.5.9 接种量
• 4.5.10 装液量
• 4.5.11 初始pH值
• 4.5.12 温度
• 4.6 小结与讨论
• 第五章 生防菌BS-5在3L发酵罐中的液体发酵工艺优化
• 5.1 引言
• 5.2 材料
• 5.2.1 菌种
• 5.2.2 培养基
• 5.3 相关试剂
• 5.4 主要实验仪器
• 5.5 方法
• 5.5.1 3L发酵罐中的分批发酵
• 5.5.2 3L发酵罐中的补料发酵
• 5.5.3 分析方法
• 5.6 结果与讨论
• 5.6.1 不控制pH和溶氧的分批发酵过程
• 5.6.2 溶氧对生物量的影响
• 5.6.3 pH对生物量的影响
• 5.6.4 分批发酵过程中的葡萄糖和氨基氮的变化
• 5.6.5 增加氮源浓度对BS-5菌株分批发酵的影响
• 5.6.6 葡萄糖补料方式对BS-5菌株发酵的影响
• 5.7 小结
• 参考文献
• 致谢