小麦成熟胚受体筛选及基因枪法转几丁质酶基因植株获得和插入位点研究

论文摘要

小麦是世界上最重要的农作物之一,也是我国种植面积最广的主要农作物之一,小麦的稳产高产直接关系着我国的经济发展和国民生活水平的提高。然而由于自然灾害、病虫害等因素的影响,使得小麦的产量大幅度下降。因此,努力提高小麦的产量和质量是现在小麦育种所面临的首要问题。基因工程育种克服了传统的育种方法育种周期长等的弱点,为小麦育种提供了一条更新的途径。通过基因工程育种,将抗虫、抗病、抗逆、增产等基因转入小麦中已经成为小麦育种的主要目的。另外,直接对农艺性状优良的小麦品种进行转基因研究会更快速的得到具有应用价值的小麦新品种。因此,筛选出具有优良组织培养特性的高产小麦品种,对小麦基因工程的发展有着重要的意义。本研究选择7个小麦品种绵阳11、川农20、川农21、川农23、川农24、川农25、川农26为实验材料,剥取小麦成熟胚并将胚根切除后进行组织培养,通过观察其组织培养特性筛选出了绵阳11和川农23这两个具有优良组培特性并且农艺性状较好的小麦基因型。随后用基因枪介导法将携带有几丁质酶基因的植物表达载体pubichitpBC1300和携带有bar基因的pAHC-20表达载体共转化,导入小麦品种绵阳11和川农23的幼胚愈伤组织中,并对再生植株进行PCR检测和基因测序,证明几丁质酶基因已经成功整合到小麦基因组中,共获得6棵含有目的基因的转基因再生植株。本研究结果如下：1.本研究选择的7个基因型小麦的成熟胚愈伤组织的诱导率都达到了95%以上,但只有两个小麦品种（绵阳11和川农23）的分化率达到45%以上,有两个小麦品种的分化率在30%以下；且也只有两个品种（绵阳11和川农23）的植株的再生率达到30%,其余五个小麦品种的植株再生率均在25%以下。基因型在成熟胚的出愈率上差异不显著,但在愈伤组织分化率和植株再生率上差异显著。经相关性分析得知出愈率与分化率和再生率并无相关性,而分化率与再生率之间存在高度相关性,所以可以认为分化率高的小麦具有更好的组织培养特性。故选择分化率高的两个小麦品种绵阳11和川农23作为小麦遗传转化体系的优良受体。2.对选择出的两个小麦品种绵阳11和川农23的幼胚进行组织培养,研究其组培特性。发现这两个基因型的小麦幼胚均具有更高的出愈率（均在96%以上）、分化率（均达到70%以上）和植株再生率（65%以上）。因此更充分的证明了选出的这2个小麦品种绵阳11和川农23具有优良的组织培养特性,可以作为小麦遗传转化体系的优良受体。3.利用选择出的两个小麦品种绵阳11和川农23的幼胚作为受体,用基因枪法将分别携带有几丁质酶基因和bar基因的质粒载体共转化,导入这两个小麦品种中,共获得了6棵转基因再生植株。4.对获得的转基因再生植株进行PCR检测,均可扩增出特异条带,初步证实所获得6棵再生植株均为阳性植株。对PCR特异条带回收后并送测序,经序列对比证实目的基因确实已经成功转入小麦再生植株中。5.根据得到的转基因阳性植株,计算基因枪转化法的转化成功率,绵阳11和川农23的转化率分别为0.45%和0.22%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 小麦转基因研究进展
• 1.1.1 小麦转基因研究方法
• 1.1.2 小麦转基因技术的应用
• 1.1.3 小麦遗传转化中存在的主要问题及对策
• 1.1.4 转基因小麦研究展望
• 1.2 几丁质酶基因工程研究进展
• 1.2.1 几丁质酶的抗病研究
• 1.2.2 植物几丁质酶的分类
• 1.2.3 植物转几丁质酶基因应用研究
• 1.2.4 几丁质酶基因工程现存问题与展望
• 1.3 TAIL-PCR技术
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小麦成熟胚、幼胚的组织培养
• 2.2.2 小麦基因枪转化
• 2.2.3 转基因植株的PCR检测
• 2.2.4 TAIL-PCR法测定外源基因的插入位点
• 3 结果与分析
• 3.1 组织培养的结果分析
• 3.1.1 不同基因型的成熟胚在组织培养上的差异
• 3.1.2 优良小麦品种的幼胚组织培养特性
• 3.2 转基因的结果与分析
• 3.2.1 基因枪转化的结果
• 3.2.2 转基因再生植株的PCR检测
• 3.2.3 转基因小麦农艺性状
• 3.3 TAIL-PCR结果
• 4 讨论与结论
• 4.1 不同基因型成熟胚在组织培育能力上的差异
• 4.1.1 不同基因型成熟胚在愈伤组织诱导率上的差异
• 4.1.2 不同基因型小麦成熟胚在愈伤组织分化率和成苗率上的差异
• 4.2 基因枪转化法各参数的选择
• 4.2.1 金粉及DNA的用量对基因枪转化的影响
• 4.2.2 高渗处理对基因枪转化的影响
• 4.2.3 筛选剂浓度和筛选时间对转化率的影响
• 4.3 TAIL-PCR技术各参数的选择
• 4.3.1. TAIL-PCR引物的设计对结果的影响
• 4.3.2. 反应程序的设计对结果的影响
• 4.3.3. 模板稀释倍数,引物比和PCR反应体系的影响
• 参考文献
• 致谢
• 附录