基于温敏性壳聚糖水凝胶的可注射性组织工程化心肌的实验研究

论文摘要

心肌梗死引起心肌死亡、心室重构并最终导致心功能衰竭。近年来,移植外源性干细胞再生心肌策略得到越来越多的关注。多种组织干细胞（间充质干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞等）和胚胎干细胞（ESC）已经被尝试用于心梗移植治疗。与组织干细胞相比,ESC具有易于向心肌细胞分化、能够与宿主心肌整合并存在电信号传导等优势,在干细胞移植治疗心肌梗死方面,具有广阔的应用前景。体内移植后易引发免疫排斥反应和畸胎瘤的形成,是ESC用于移植治疗的两大难题。治疗性克隆技术有望解决ESC体内移植后引发免疫排斥反应这一难题。近年来,单纯干细胞移植治疗心肌梗死已经取得明显进展,大量动物实验结果表明,单纯干细胞移植能在短期内改善心功能,但长期疗效仍不明显。有研究报道表明,单纯干细胞心梗部位移植存在细胞滞留率与存活率低、对移植细胞缺乏有效的增殖调控手段等问题。基于此,国内外研究人员采用多种办法来改善心梗部位注射效果。其中,基于可注射性生物材料的工程化心肌组织体内移植是目前最有应用前景的方法之一,近年来研究报道很多,也取得了明显效果。温敏性壳聚糖水凝胶具有良好生物相容性、生物降解性,易于携带可促进组织再生的生物活性物质（生长因子、基因、细胞等）,受到研究人员的广泛关注。近年来,温敏性壳聚糖水凝胶作为细胞载体支架用于组织工程研究已经取得了明显进展,广泛应用于软骨、神经、肝脏等组织或器官的再造研究。目前尚未见应用温敏性壳聚糖水凝胶携带胚胎干细胞进行可注射性组织工程化心肌体内心梗部位移植的实验研究报道。此外,采用重构胚来源的胚胎干细胞（nt-ESC）进行心肌梗死部位移植（单纯细胞移植或与支架材料联合移植）的研究也未见报道。本研究首先建立了大鼠心梗模型和心功能检测方法。其次,制备了温敏性壳聚糖水凝胶,并对其生物学性能进行了评价。在此基础上,分别采用mESC、nt-mESC为种子细胞,以温敏性壳聚糖水凝胶为载体,体外构建可注射性组织工程心肌,并将其注射到大鼠心肌梗死部位,深入研究了mESC、nt-mESC来源的可注射性组织工程化心肌对体内受损心肌的损伤修复能力。本论文的主要研究内容包括以下四个部分:第一部分:建立大鼠心梗模型和心功能检测方法心肌梗死动物模型及心功能检测方法的建立是可注射性组织工程化心肌研究的前提和基础。本部分研究选用大鼠作为实验动物,通过结扎左冠状动脉前降支的方法建立动物心梗模型,并通过心脏超声、血流动力学检测等方法检测心功能。结果表明,结扎左冠状动脉前降支可以造成左心室前壁透壁性心肌梗死,大鼠心功能明显下降。心脏超声和血流动力学检测结果是反映和评估心脏功能变化的重要指标。本部分成功制备了大鼠心梗模型,术中及术后成活率均较高,建立了实用、可靠的心功能检查方法,为下一步可注射性组织工程心肌的移植研究打下了坚实基础。第二部分:温敏性壳聚糖水凝胶的制备及生物学评价由于壳聚糖原料的品牌、批号的不同以及纯度、脱乙酰度等理化性质的差别明显,此外,组成壳聚糖水凝胶的组分及比例也不尽相同,使得不同实验室制备的壳聚糖水凝胶材料其最终理化性质不完全相同。本研究中我们参考文献的方法,以氯化壳聚糖、β-甘油磷酸钠为原料,羟乙基纤维素为交联剂,制备了温敏性壳聚糖水凝胶。在此基础上,将mESC与该水凝胶复合,体外培养3天,应用AO/PI染色观察mESC在水凝胶中的存活情况。此外,还将制备的温敏性壳聚糖水凝胶进行大鼠心肌部位注射移植,检测了其组织相容性及体内生物降解性。结果表明:研制的温敏性壳聚糖水凝胶具有温度敏感特性,其在室温条件下为液态,当温度升高到37℃时,交联成网状多孔的固态。生物学评价研究证实其具有良好的细胞相容性、组织相容性及生物降解特性,并且可以明显促进心肌部位微血管的生成。因此,研制的温敏性壳聚糖水凝胶是可注射性心肌组织工程研究的良好载体材料。第三部分:以mESC为种子细胞构建可注射性组织工程化心肌研究本研究采用mESC为种子细胞、液态温敏性壳聚糖为支架构建可注射性组织工程心肌,并将其通过注射的方法移植到大鼠心肌梗死部位,移植后,针对细胞24h滞留率,细胞4w存活率、心梗面积、室壁厚度、心梗部位微血管密度等指标进行检测,并利用超声及血流动力学检测方法对移植4w后心肌梗死大鼠的心功能进行测定。结果表明:温敏性壳聚糖水凝胶作为mESC载体,能显著提高移植细胞在注射区域的滞留率及存活率。移植术后4w检测,心肌梗死部位心室壁厚度明显增加并显著改善了心梗模型动物的心功能。目前尚未见应用温敏性壳聚糖水凝胶携带mESC进行可注射性组织工程化心肌的研究。第四部分:以nt-mESC为种子细胞构建可注射性组织工程化心肌研究本部分研究首先用0.1mg/ml抗坏血酸为诱导剂对nt-mESC向心肌细胞分化能力进行了研究,在此基础上,以nt-mESC为种子细胞复合温敏性壳聚糖水凝胶,体外构建可注射性组织工程化心肌并进行大鼠心梗部位移植。移植后,针对细胞24h滞留率,4w存活率、心梗面积、室壁厚度、心梗部位微血管密度、nt-mESC在心梗部位分化情况等指标进行检测,并利用超声及血流动力学检测方法对移植4w后心肌梗死大鼠的心功能进行测定。结果表明:nt-mESC体外可以分化为心肌细胞。以nt-mESC为种子细胞构建可注射性组织工程心肌可以显著改善心梗模型的心功能,显著缩小了心梗面积并增加了室壁厚度。基于nt-mESC的可注射性组织工程化心肌具有较强的心肌损伤修复能力。目前应用nt-mESC单纯或者与生物材料复合移植修复心肌梗死的研究尚未见报道。综上所述,本研究成功建立了大鼠心梗模型和心功能检测方法,研制了温敏性壳聚糖水凝胶,并经生物学评价证实其具有良好的细胞相容性、组织相容性及生物降解特性,是心肌组织工程种子细胞较为理想的载体材料。在此基础上,以温敏性壳聚糖水凝胶为载体,并分别以mESC、nt-mESC为种子细胞构建的可注射性组织工程化心肌均具有良好的心肌损伤修复能力,对于未来缺血性心脏病的治疗具有重要意义。此外,本研究通过可注射性支架材料的引入,将为解决目前单纯细胞移植治疗心肌梗死研究中存在的关键技术问题,如细胞运输、体内存活与增殖调控等方面的障碍,提供了一条新的策略。

论文目录

• 英文缩略语索引
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 大鼠心梗模型的建立及心功能检测
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 温敏性壳聚糖水凝胶的制备及生物学评价
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 m ESC 为种子细胞的可注射性组织工程化心肌研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第四部分 nt-mESC 为种子细胞的可注射性组织工程化心肌研究
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 文章发表情况
• 个人简历
• 致谢