论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种常见的慢性、进行性中枢神经系统（central nerve system, CNS）退行性疾病。其临床主要表现为进行性的记忆衰退和认知功能的下降,行为异常和社交障碍,通常病情呈进行性加重。主要病理特征表现为脑神经细胞外β-淀粉样蛋白（beta-amyloid protein, Aβ）沉积形成老年斑,脑神经细胞内tau样蛋白异常聚集形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFT）。随着全球人口老龄化的快速发展,AD的发病率正日益增高,已成为继冠心病、肿瘤、中风之后危及老年人生命的第四大病因。由于对AD的病因和发病机制的认识尚不清楚,在治疗方面存在极大的困难,目前还没有根治的方法,所以如何预防和治疗AD已成为世界所关注的问题。神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是指CNS中具有无限增殖能力和多向分化潜能的细胞,可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。当CNS中神经细胞发生变性或死亡时,其内源性NSCs通过增殖、迁移、分化加以补充修复,为促进CNS再生提供种子细胞。但通过迁移外源性NSCs治疗AD并不理想。其原因可能是除NSCs本身的质量问题外,更重要的可能是AD患者颅内微环境发生改变,不适合NSCs生存和潜能的发挥。近年来,国内外大量的研究表明AD的发生、发展与中枢炎症有关。认为AD是Aβ沉积引起的继发性慢性炎性反应,也是导致胆碱能神经元退行性变的重要原因。参与CNS炎性反应的细胞主要有小胶质细胞和星形胶质细胞,有文献报道其激活后可释放多种细胞因子、趋化因子、补体及其激活物,导致非特异性炎性细胞浸润,产生慢性炎症,破坏了脑内NSCs增殖和分化的环境,造成来源于“神经细胞库”中的NSCs或者移植NSCs不能发挥正常的功能,使其增殖、分化功能受抑,或迁移能力减退,从而导致丢失的神经细胞得不到及时补充。那么,明确Aβ介导的炎性反应能否造成NSCs失能以及削弱炎性反应能否改善NSCs生存环境,促进其增殖、分化能力,减少其凋亡的研究就具有非常重要的意义。如何有效控制Aβ引起的颅内炎症,改善NSCs生存环境?有研究显示迷走神经释放的递质激活巨噬细胞上的烟碱型乙酰胆碱受体（α7-nAChR）后,能抑制外周炎性反应。在CNS中,虽然缺乏外周巨噬细胞,但有巨噬样的小胶质细胞和星形胶质细胞参与Ap介导的炎性反应,我们前期研究已经证明这些细胞上都有α7-nAChR表达,Ap在体外可诱导星形胶质细胞1L-6、1L-1β、TNF-α和趋化因子MIP-1、RANTES增加；也可诱导小胶质细胞分泌1L-6、1L-1β、TNF-α增加,激活小胶质细胞和星形胶质细胞α7-nAChR可削弱Ap对P38MAPK、P42/44MAPK通路的激活,调控炎性细胞因子和趋化因子的生成和分泌,使Ap介导的这些炎症因子的生成和分泌降低,其中激活星形胶质细胞α7-nAChR,对趋化因子的削弱作用最为明显,激活小胶质细胞α7-nAChR,对炎性因子的分泌有明显的抑制作用。那么,激活小胶质细胞α7-nAChR是否能改善Ap蛋白介导的NSCs生成的微环境,这一假设亟待研究。基于上述研究,本课题首先利用无血清悬浮培养法从新生大鼠海马中培养出高纯度、高活力的NSCs;在体外建立细胞炎性反应模型,观察Ap蛋白对NSCs增殖、分化、凋亡的影响；然后利用transwell共培养小胶质细胞和NSCs,并通过激活小胶质细胞α7-nAChR,探讨小胶质细胞α7-nAChR激活在Aβ蛋白介导的神经干细胞生成中的作用,为寻求AD的治疗靶点提供实验基础。方法1. NSCs分离培养及鉴定取出生24h内SD大鼠,75%酒精浸泡5min,无菌条件下,取出大脑,剥离脑膜和血管,显微镜下分离海马组织,用眼科剪剪碎,吸管轻轻吹打；以0.125%胰酶37℃消化15min,以含10%FBS的DMEM/F12终止消化,1000转/分,离心5min,弃上清；用含20ng/ml EGF （epidermal growth factor）、20ng/ml bFGF （basic fibroblast growth）、2%B27、1%青链霉双抗的DMEM/F12培养液重悬。原代培养至7d时进行传代培养。传代细胞部分用5-溴-2脱氧尿嘧啶核核苷（5-bromo 2-deoxyuridine, BrdU）标记检测培养细胞的增殖能力；部分细胞行巢蛋白（Nestin）免疫细胞荧光染色；部分细胞用含10%FBS （fetal bovine serum）的DMEM/F12培养液进行诱导分化,分化7d后分别行胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillary acidic protein, GFAP）和微管相关蛋白-2（microtubule-assoiate protein, MAP-2）免疫细胞荧光染色。2.小胶质细胞培养及鉴定无菌条件下,取新生SD大鼠海马组织,经0.125%胰蛋白酶消化后离心,弃上清,用含10%FBS的DMEM/F12培养基重悬,制成单细胞悬液,细胞计数后,按5×105个活细胞/mL,接种至细胞培养瓶中培养。待培养至7-9天,用12mmol/L利多卡因分离纯化小胶质细胞,并通过小胶质细胞特异性抗体CD11b/c进行免疫细胞化学检测,同时以Hoechst33258对细胞核进行复染。3.transwell共培养利用孔径0.4μm的transwell半透膜仅可以通过培养液而不能透过细胞的特点,在6孔塑料培养板上架起transwell半透膜,建立双层细胞共用培养液而不直接接触的培养体系。将transwell作为培养体系上层,接种NSCs,培养体系下层为6孔塑料培养板,接种纯化后的小胶质细胞,研究小胶质细胞分泌物对NSCs的影响。4.Ap蛋白对NSCs增殖、分化及凋亡的影响以及激活激活小胶质细胞a7-nAChR对NSCs的保护作用根据实验目的分为空白对照组、Ap蛋白组、共培养组（用transwell进行NSCs与小胶质细胞共培养）、烟碱预处理组。然后对各组培养的NSCs进行增殖能力（Brd阳性细胞核的百分率）、和分化能力（GFAP、MAP-2和CHAT）的检测；用Annexin V-FITC/PI和Fluoreseein Frag ELTM DNA Fragmentation Detection Kit凋亡试剂盒检测各组NSCs的凋亡率。5.统计学处理所有统计分析均用SPSS13.0 （statistical package for social science）社会科学统计软件包完成,各组检测结果以均数±标准差（x±s）表示,组间比较用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,方差不齐时用Welch法。两两比较时,若方差齐性,则采用最小显著差法（least signineant diffrence, LSD）;若方差不齐,则采用DunnettT3方法。显著性水平为：a＝0.05。结果1.NSCs的分离培养及鉴定：原代和传代培养的NSCs都能快速增殖并形成神经球,显微镜下观察：球体透亮,形态规则,边缘整齐,边界清晰,排列紧密,周边有亮的光晕,培养液中悬浮生长。经免疫荧光鉴定神经球细胞均表达NSCs特异性标志物Nestin;所获得的细胞能将BrdU结合到细胞核中；部分细胞能分化为星型胶质细胞和神经元。2.小胶质细胞培养与鉴定：原代细胞主要是以星形胶质细胞为主,并含有小胶质细胞、神经元和少量的少突胶质细胞。待细胞生长出现分层后,通过盐酸利多卡因分离获得小胶质细胞。显微镜下观察：小胶质细胞胞体扁平或卵圆形,突起细长。经免疫荧光检测,95%的细胞均呈CD11b/c阳性。3.Aβ蛋白对NSCs增殖的影响：用BrdU掺入法检测NSCs的增殖能力,对照组、Ap蛋白组、共培养组和Nicotine处理组4组的NSCs增殖率分别为77.69%±4.45%,52.37%±4.89%,28.67%±2.96%,39.40%±2.99%。结果显示：四组间比较有显著性差异（F=576.875,P=0.000）；用transwell将小胶质细胞与NSCs共培养3d后,再用Ap作用于小胶质细胞96h,此时共培养组NSCs的增殖率显著低于Ap组（P<0.001）；用Nicotine预先激活小胶质细胞a7-nAChR后,NSCs增殖率显著高于transwell共培养组（P<0.001）,但各组的增殖率都显著低于对照组（P<0.001）。4.Ap蛋白对NSCs分化成神经元的影响用含10%FBS的DMEM/F12培养基诱导分化培养7d的NSCs,分化5d后,将Ap蛋白作用于空白对照组、Ap作用组、共培养组、烟碱处理组,作用96h后,流式细胞仪检测各组分化成MAP-2阳性率。结果显示：在含10%FBS的DMEM/F12培养基的正常分化条件下,NSCs分化成神经元的比例是14.58%；加Ap作用96h后,仅有10.27%细胞表达MAP-2阳性率,神经元比例显著降低（P<0.001）；在有小胶质细胞共培养的条件下,Ap对NSCs分化成神经元的影响更加显著,NSCs分化为神经元的比例仅为5.36%；预先加入Nicotine激活小胶质细胞a7-nAChR后,NSCs分化成神经元比例增加到8.06%,与共培养组相比,差异具有统计学意义（P<0.001）；各组与对照组比较,差异具有显著性（F=666.32,P=0.000）。5.Aβ蛋白对NSCs分化成胆碱能神经元的影响流式细胞仪检测各组NSCs分化成CHAT的阳性率,结果显示：单独加入Ap作用后NSCs分化成胆碱能神经元的比例为3.04%,明显低于正常组（F＝202.83,P=0.000）；当用transwell将小胶质细胞与分化的NSCs共培养后,加入Ap作用96h, NSCs分化成胆碱能神经元的比例不到1%；加入Nicotine预先激活小胶质细胞a7-nAChR 60min后,再加Ap蛋白作用,NSCs分化成胆碱能比例升高到2.15%,高于共培养组（P<0.001）,但仍低于空白对照组（P<0.001）,差异具有显著性。6.Aβ蛋白对NSCs凋亡的影响以及激活小胶质细胞a7-nAChR对NSCs的保护作用：用TUNEL标记的方法定性检测NSCs的凋亡,在荧光显微镜下观察,发现Aβ作用组神经球内部出现大量绿色荧光,出现大量凋亡细胞,其次是共培养组,而烟碱处理组TUNEL免疫染色阳性细胞明显减少,对照组不显示绿色荧光。流式细胞仪定量检测各组NSCs出现的凋亡率,对照组、Ap蛋白组、共培养组和烟碱处理组4组的凋亡率分别为6.50%±0.56%,25.77%±0.48%,45.19%±0.52%,29.17%±0.86%。结果显示：transwell共培养组NSCs的凋亡率高于Aβ单独作用组（P<0.001）；用烟碱预处理激活小胶质细胞α7-nAChR后,NSCs凋亡率显著低于transwell共培养组（P<0.001）,但还是高于对照组（P<0.001）,差异具有统计学意义（F=2175.97,P＝0.000）。结论1.从新生SD大鼠海马组织成功分离、培养出了大鼠神经干细胞,呈Nestin阳性,具多向分化潜能,能分化为星形胶质细胞（GFAP）和神经元（MAP-2）阳性细胞。2.利用盐酸利多卡因成功分离了纯化小胶质细胞,经CD11b/c检测,纯度高达95%,可用于transwell共培养实验。3.Ap蛋白抑制了NSCs的增殖,促进其凋亡,能显著降低其分化成神经元尤其是胆碱能神经元的能力。4.通过尼古丁能成功激活小胶质细胞的α7-nAChR,已激活α7-nAChR的小胶质细胞对NSCs有一定的保护作用,能促进NSCs的增殖能力,可促进其分化成神经元尤其是胆碱能神经元的能力。