论文摘要
目的和意义：宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,世界范围内每年大约有50万左右的新发病例,我国的患病率及病死率约占世界的1/3,其死亡率居女性肿瘤的第2位,已成为危害女性身体健康的主要杀手之一。大量研究显示,人乳头瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）感染是宫颈癌及宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelialneoplasia, CIN）的直接和主要病因。宫颈癌患者的HPV检出率可达99.17%,其归因危险百分比达90%以上。HPV有100多种亚型,其中与泌尿生殖道感染相关的有40余种。根据其对生殖系统的致癌性可分为低危型和高危型,前者主要引起尖锐湿疣等良性病变,后者常引起宫颈癌等恶性病变。由于HPV的致病性及致癌性与其亚型密切相关,不同亚型以及高危型及低危型感染所导致的结果截然不同,而且同一高危亚型持续感染是导致癌变的主要因素,所以对其进行检测和分型对于临床诊断、癌变预防与治疗具有重要意义。液相芯片是基于LuminexTM的一种多功能生物芯片的分析平台,有机整合了编码微球（color-coded microspHere or bead）、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则,使其具有高通量,高灵敏度,高速度等特点。理论上Luminex法可以对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测,而新开发的Luminex XMAP更能一次性检测到500种目的分子,在35～60 min内可对96个不同样本进行检测,且灵敏度高,信噪比好,只需要微量的样本即可进行检测,价格低廉,可以广泛用于大规模流行病学的调查、临床样本的筛查、监视治疗干预和评价疫苗效果[5,6］。近年来,随着液相芯片技术的日渐成熟,其在病原微生物的基因诊断中也得到了广泛应用。研究内容：本研究利用LuminexTM技术平台,选取与临床感染密切相关的HPV 23种高、低危型别（低危型包括HPV6,11,42,43,44等5种,高危型主要为HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,73,82,CP8304等18种）作为研究对象,选取23种型别的HPV样本,经测序及Blast验证为相应型别,将各型别L1区PCR产物进行重组克隆构建质粒库,作为阳性参照标准。设计基因分型检测系统,并对HPV通用引物和探针进行了筛选,建立PCR反应体系、杂交反应体系,对影响杂交反应的因素进行系统的分析,获得最佳反应条件。质粒标准品的检测结果证明该方法可对HPV准确分型。为确立阳性诊断的标准,根据具有统计学意义的多次检测结果确定质控标准及参考值。以构建的HPV液相芯片基因分型系统对314例单一型和混合型临床HPV感染样本进行检测,同时以测序法作为检验标准,对Luminex法的准确度、特异性、灵敏度进行评价,为Luminex法运用于临床HPV基因分型检测做可行性研究。研究方法：1.构建23个型别的HPV-Ll区质粒标准品库：通过查找genbank中待检测的23种型别的HPV序列,选择L1区的MY09/11引物扩增区作为目标序列。用HPV-PCR检测试剂盒对临床收集的样本进行HPV检测,对结果阳性者进行测序确认为23种待检测的型别。将每种型别的MY09/11引物扩增区的PCR产物进行纯化、重组克隆。对克隆质粒经测序再鉴定,检索GenBank,确认为相应型别。保存HPV6,11,42,43,44,16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,73,82,CP8304等23种型别的阳性克隆。作为HPV分型的阳性标准品库。2.HPV基因分型液相芯片检测系统的建立：PCR体系的建立：针对23种型别HPV的目标检测序列,采用通用型引物MY09/11用于扩增HPV L1区的高保守区,同时设计一条引物P8用于扩增部分通用引物不能兼顾的型别。扩增产物为450bp。内参引物PC01/02用于扩增人β-Globin基因,对样本提取及PCR过程进行质控,产物大小为221 bp。目标扩增区域及内参片段的上游引物采用生物素标记,以便于液相芯片杂交检测。通过对阳性标准品及样本的扩增对PCR体系各组份以及PCR程序进行优化获得最佳扩增条件。杂交体系的建立：根据HPV-Ll区基因序列特点,设计针对23种HPV型别的特异性探针；同时设计针对内参β-Globin片段的质控探针,对HPV分型检测系统的样本提取及PCR过程进行质控。探针5’端以氨基修饰,25条探针按照LuminexTM平台技术方案分别偶联至特定编码的羧基微球上,制备成HPV分型检测的液相芯片。通过与阳性标准品的PCR产物进行杂交并以LuminexTM200进行检测,对杂交体系的各组份及杂交温度（45℃、50℃、55℃、58℃）进行优化。通过对多型标准品PCR产物的等比及不等比混合样品的检测,确定HPV基因分型液相芯片检测系统对临床混合型标本的检测性能；通过对同一标准品的5次检测,确定检测系统的重复性。3.参考值确定及质控体系建立根据阳性标准品检测结果,确定判别检测结果的参考值,并以感染率最高的HPV16型作为检测系统的阳性质控品。检测体系中的阳性内参探针（PC）对样本提取及PCR体系进行质控,显色内参探针（CC）对微球偶联效率及杂交后显色过程进行质控。4.大样本检测对所建立液相芯片检测系统的性能评价：收集314例临床样本,为女性生殖道疾病患者及健康体检者的尿道分泌物、宫颈脱落细胞或疣体细胞保存液。用煮沸法提取样本DNA备用。以测序法作为验证标准,采用所建立的Luminex法对314例HPV样本进行基因分型检测,同时所有样本以测序法进行验证。以测序法作为检验标准,通过统计学方法计算,对Luminex法用于HPV分型检测的灵敏度,特异性,准确度等指标进行评价。结果：1.对临床23种型别的HPV阳性样本进行PCR扩增,将扩增产物重组克隆,经测序验证,构建了HPV6,11,42,43,44,16,18,31,33,35,39,45,51,52,53,56,58,59,66,68,73,82,CP8304的阳性标准品（质粒）。2.本研究建立的液相芯片系统,通过对构建的阳性标准品进行检测,确定了PCR引物序列,以及PCR体系中各引物、DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs等各组份的浓度和比例,并确定了PCR最适反应程序。在确定的体系中,HPV扩增区及内参片段能得到强扩增。3.以本研究建立的液相芯片系统对各型别的HPV标准品扩增产物进行杂交检测,杂交温度为50℃和45℃时存在交叉错配信号,检测结果本底较高；杂交温度为58℃时,部分HPV型别的PCR产物杂交信号很弱或无信号；杂交温度为55℃无交叉错配信号,且各标准品与相应探针均有杂交信号。以上各温度杂交时,内参探针均有强阳性信号。4.对314例样本进行检测,以测序法作为检验标准,液相芯片分型检测结果为：灵敏度98.10%,特异性98.08%,符合率98.09%。Kappa-致性检验结果为0.962。讨论测序法通过HPV相对保守的晚期基因L1区约450bp片段与Genebank中相应型别的HPVL1段进行Blast,从而区分不同型别。而Luminex法通过L1片段内型特异性的20bp左右的探针来区分,因此在单型感染的检测技术中,测序法的结果可以排除杂交产生的假阳性,是分子诊断的金标准。但测序法分型的技术本身存在缺陷：PCR引物在扩增中具有选择性,在HPV多型混合感染样本中,由于扩增效率不同或者某种型别的HPV病毒浓度占优势,造成扩增不均一,测序法无法分辨出劣势扩增或低浓度病毒的型别,造成假阴性,将混合型误判为单一型,或者出现杂峰图形,无法判别HPV型别。解决该问题的方法就是通过克隆构建文库,挑选不同的单克隆进行再次测序,但这种方法周期长,操作复杂,成本高,同时也存在漏检某些型别的可能性。所以在多型HPV感染的分型方面Luminex法有检测周期短、、操作简单、本低的优势[5],而HPV多型混合感染十分常见。Luminex法结果表明,选择Luminex推荐的杂交体系,可以有效控制本底[6]。通过314例样本的检测,对于检测结果应该为阴性的探针,其荧光值可以控制在100以下。而相应型别阳性的探针,荧光值可比阴性探针的值高出几十到几百倍。以测序结果为标准,选取荧光值最高的阴性结果,以该荧光值的2作为所有探针的阳性判定值（cut-off值）,高于cut-off值就视为该型别的阳性。用Luminex法进行HPV基因分型检测,有少数样本得到的分型结果与测序法不一致。如某样本测序的结果是6型,而Luminex法的结果是11型,某样本测序为52型而Luminex法为66型等。出现这种结果原因在于Luminex法对探针设计的局限性,Luminex法要求探针一般为20bp左右,而某些样本部分碱基存在变异,无法与根据标准序列设计的探针完全匹配导致漏检,或出现特异性降低而与多个探针结合的情况导致假阳性[7,8］。结合我国女性HPV感染的分子流行病学研究,筛选出临床感染较常见又有临床意义的高、低危亚型用于HPV DNA液相芯片的设计,指导临床筛查、诊断、癌变预防及治疗工作。目前国内对HPV进行分型检测的方法有导流杂交法,以及反向斑点杂交（RDB）法等[9]。导流杂交检测速度快,但其检测结果假阳性率明显高于其他方法,RDB法操作较为繁琐,且通过肉眼判断结果,主观性因素多,结果判断不够科学。本研究基于Luminex平台,检测流程快捷,结果客观可靠,优势明显。且针对HPV感染的型别地域流行性差异,还可自由选择HPV某几种型别进行检测,灵活性好。结论：Luminex法可以用于HPV基因分型检测,且在检出率、特异性及检测通量方面能够达到临床诊断检测的要求,适应临床实际应用,尤其是具有高通量优点,适用于临床大范围大样本筛查。