棉铃虫细胞色素P450基因的克隆与表达

论文题目: 棉铃虫细胞色素P450基因的克隆与表达

论文类型: 博士论文

论文专业: 农业昆虫与害虫防治

作者: 马彩霞

导师: 刘惠霞

关键词: 棉铃虫,细胞色素,差异显示技术,基因表达

文献来源: 西北农林科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 细胞色素P450 单加氧酶系是一类广泛分布于生物有机体中的重要酶系,它能够代谢多种内源性物质和外源性物质,因其生物学的重要性,一直是生物学领域研究的一个重要对象。棉铃虫Helicoverpa　armigera 是一种在世界范围内普遍发生的重要害虫,能导致多种不同作物的严重损失。为深入了解棉铃虫细胞色素P450 的结构与功能,我们就棉铃虫细胞色素P450 基因的克隆及异源表达开展了研究,主要研究结果如下:　根据细胞色素P450 血红素结合区的保守序列,设计了8 条P450 特异性引物,应用基于mRNA　差异显示(mRNA　differential　display　RT-PCR)的基因分离技术,从6 龄实验室品系棉铃虫中肠组织中成功克隆了一条在棉铃虫中肠组织中表达的细胞色素P450 基因的EST(Expressed　Sequence　Tag)片段。该片段长324bp,包括细胞色素P450的保守序列F--G---C-G,及完整的3′非编码区,其中编码区长197bp,编码67 个氨基酸残基,完整的3′非编码区长127bp,在poly(A)尾上游-25bp 处存在一AATAAA 加尾信号。　利用5′RACE(Rapid　Amplification　of　cDNA　Ends)技术,以EST片段的序列信息为基础,设计特异引物GSP与通用引物AUAP扩增该EST的5′端,对5′RACE产物进行了克隆和测序。测序结果表明:5′RACE片段长1605bp,并在5′端存在起始密码子ATG和部分或全部5′非编码区,其中3′端的PFGFGPRNCIG序列和EST序列完全一致。进而对EST序列和5′RACE片段的序列进行拼接,从而获得该细胞色素P450　cDNA的全长序列信息。结果表明:该cDNA全长为1893bp,其中5′非编码区长173bp,编码区长1593bp,编码一个由531个氨基酸残基组成的蛋白质,3′非编码区长127bp。用有关生物学软件对该蛋白质进行预测,该蛋白质分子量为61kDa,等电点为8.30,并且在N-基末端存在一高疏水的信号肽序列,这个特点是所有真核生物微粒体细胞色素氧化酶的共同特点。该cDNA序列已登录GenBank数据库,登录号为:AY753201,并由D.Nelson　命名为CYP9A17。CYP9A17分别与来源于棉铃虫的CYP9A12、CYP9A14、烟芽夜蛾的CYP9A1、德国蜚蠊的CYP9E2、小菜蛾的CYP9G2和冈比亚按蚊的CYP9L1的氨基酸序列相似性为:93%、62%、54%、42%、40%和38%。　根据CYP9A17 cDNA的全长序列信息,合成代表CYP9A17　cDNA　5′和3′两编码区末端的引物,运用RT-PCR方法,直接从棉铃虫cDNA库体外扩增棉铃虫CYP9A17　编码区cDNA的拷贝。该编码区cDNA拷贝被克隆进pGEM-T　easy载体。测序结果证明,已成功构建了棉铃虫细胞色素P450　CYP9A17编码区的cDNA克隆,为进一步研究该基因的结构、功能和调控创造了便利的条件。

论文目录:

第一章 前言

Ⅰ 文献综述

1.1 细胞色素P450 酶系与细胞色素P450

1.1.1 细胞色素P450 酶系

1.1.2 细胞色素P450

1.1.3 细胞色素P450 的基因

1.1.4 P450 的多样性

1.2 昆虫P450 酶系的重要功能

1.2.1 P450 酶系催化内源性物质代谢

1.2.2 P450 酶系催化外源性物质代谢

1.3 分离昆虫细胞色素P450 的方法

1.3.1 通过蛋白纯化

1.3.2 用已知的P450 基因做探针

1.3.3 设计简并引物

1.3.4 基因组测序

1.3.5 差异或差减筛选

1.4 棉铃虫P450 酶系

1.4.1 棉铃虫P450 基因

1.4.2 P450 蛋白的结构

1.4.3 P450 与棉铃虫抗药性

1.5 昆虫细胞色素P450 基因的异源表达

1.5.1 大肠杆菌表达系统

1.5.2 杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统

1.5.3 酵母表达系统

1.6 mRNA差异显示技术

1.6.1 m RNA差异显示技术的原理

1.6.2 DDRT-PCR 技术的优缺点及改进

Ⅱ 本研究的立题依据及主要研究内容

2.1 立题依据

2.1.1 P450 重要的生物学意义

2.1.2 棉铃虫的经济学意义

2.1.3 棉铃虫细胞色素P450 的分子生物学研究薄弱

2.2 本研究的主要内容

第二章 棉铃虫细胞色素P450 基因EST序列的获得

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 实验方法

2.2 结果与分析

2.2.1 棉铃虫中肠组织中总RNA 提取

2.2.2 mRNA差异显示分析

2.2.3 目标片段的再次扩增

2.2.4 目标条带的亚克隆

2.2.5 DNA 片段的序列测定和分析

2.3 讨论

2.3.1 棉铃虫细胞色素P450 EST序列的获得

2.3.2 P450 非简并特异性引物设计及其优点

2.3.3 mRNA差异显示技术条件的优化

2.3.4 染色技术

第三章 棉铃虫细胞色素P450 5′端CDNA基因的克隆

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 棉铃虫细胞色素P450 EST片段的5′RACE 扩增

3.2.2 5′RACE片段的克隆

3.2.3 棉铃虫细胞色素P450 5′端序列分析

3.2.4 棉铃虫细胞色素P450 CYP9A17 cDNA 全序列分析

3.2.5 棉铃虫细胞色素P450 CYP9A17 理化特性及二级结构预测分析

3.2.6 棉铃虫CYP9A17 和其它细胞色素P450 的9 家族序列的相似性分析

3.2.7 CYP9A17 的进化分析

3.3 讨论

3.3.1 5′RACE技术的应用

3.3.2 棉铃虫细胞色素P450 CYP9A17 全长序列分析

3.3.3 有关CYP9A17 推导的氨基酸的功能预测

第四章 棉铃虫细胞色素P450 CYP9A17 全长CDNA克隆的构建

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 方法

4.2 结果与分析

4.2.1 CYP9A17 全长cDNA的扩增

4.2.2 目的片段的回收及鉴定

4.2.3 目标片段的序列分析

4.3 讨论

第五章 CYP9A17 在棉铃虫不同发育阶段的表达

5.1 材料与方法

5.1.1 材料

5.1.2 实验方法

5.2 结果与分析

5.3 讨论

第六章 棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7 基因的克隆和表达

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.2 实验方法

6.2 结果与分析

6.2.1 棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7 基因的克隆

6.2.2 棉铃虫CYP6B7 内含子的消除

6.2.3 棉铃虫CYP6B7 在大肠杆菌中的表达

6.3 讨论

6.3.1 CYP6B7 基因的克隆

6.3.2 有关CYP6B7 表达的研究

第七章 总结

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-12-22

参考文献

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