论文摘要
慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia,CML）的发生是由于t（9;22）（q34;q11）易位所致的bcr/abl融合基因,编码产生了具有强烈酪氨酸激酶活性的BCR/ABL融合蛋白,该融合蛋白激活多条信号转导通路、导致一系列蛋白质的表达异常,诱发细胞恶性转化。尽管其具体分子机制仍然有待阐明,但越来越多的证据显示细胞DNA损伤修复功能的失常在CML发生发展以及耐药性表型中起重要作用。有鉴于此,我们选择以DNA的损伤修复功能为切入点,运用比较蛋白质组学对比分析BCR/ABLp210转化细胞株与对照细胞株在经DNA损伤后的细胞蛋白质组表达差异,为从整体角度探讨BCR/ABL融合蛋白对DNA损伤修复功能的影响提供蛋白质水平变化的信息。实验分三个部分进行研究,主要方法、结果及结论如下:1.稳定表达BCR/ABL融合蛋白的小鼠BaF3-P210细胞株的建立及其生物学特性的研究将含有bcr/abl基因的逆转录病毒载体转染到包装细胞,收集病毒感染小鼠BaF3细胞,经筛选和亚克隆,获得稳定表达BCR/ABL融合蛋白的BaF3-P210转化细胞;用PCR、DNA测序、RT-PCR和Westernblot检测bcr/abl基因在BaF3-P210细胞中的整合和表达;用台盼蓝细胞计数法、流式细胞仪（FCM）和MTT法研究BCR/ABL融合蛋白对BaF3细胞生物学特性的影响。结果发现:bcr/abl基因整合在BaF3细胞基因组中,BaF3-P210细胞能稳定表达bcr/abl基因及其蛋白。与对照组相比,BaF3-P210细胞增殖速度增快（P <0.05）;G0/G1期细胞比例下降,S期和G2/M期细胞比例增高（P <0.05）;经STI571处理后的细胞增殖抑制率为（54.08±1.90）%（P <0.05）,早期凋亡率为（12.35±2.04）%（P <0.05）。2. BaF3-P210细胞和对照BaF3-MIGR1细胞DNA损伤模型的建立及其修复的动态观测选择过氧化氢（H2O2）为细胞DNA损伤的处理因素,采用彗星实验检测不同浓度H2O2诱导的BaF3-P210细胞和空载体感染细胞BaF3-MIGR1的DNA损伤以建立DNA损伤模型;继而用彗星实验对两组细胞在DNA损伤后的修复情况进行不同时间段的动态观测。实验发现,BaF3-MIGR1细胞和BaF3-P210细胞DNA损伤模型的建立条件是:均采用50μmol/L终浓度的H2O2进行染毒,H2O2作用温度和时间为4℃,10 min。而BaF3-P210细胞与BaF3-MIGR1细胞相比DNA损伤后修复时间缩短,在损伤后60 min即可达到完全修复,而后者在损伤后120 min才能完全修复（P <0.05）。3.BaF3-P210细胞与对照BaF3-MIGR1细胞在经H2O2诱导DNA损伤后的比较蛋白质组学分析采用双向凝胶电泳技术对各样品组全细胞蛋白进行分离,通过优化条件参数来确定合适的样品上样量和聚焦时间。用PDquest（7.0）软件对扫描的二维凝胶电泳图像进行分析,筛选出BaF3-P210细胞与BaF3-MIGR1空载体感染对照细胞在经H2O2诱导DNA损伤后的差异表达蛋白斑点。候选差异表达蛋白斑点经胶内胰酶酶解,MALDI-TOF-MS分析,得到肽指纹图谱（peptide mass fingerprinting, PMF）,使用Mascot软件在SWISS-PROT数据库中检索鉴定差异表达蛋白质,并对差异蛋白质进行生物信息学分析。结果发现:通过优化条件,最终确定合适的样品上样量为150μg、最佳聚焦时间为70,000总伏特小时。通过对BaF3-P210细胞与BaF3-MIGR1细胞分别经H2O2处理后细胞组的二维凝胶电泳图像进行对比分析,发现约有41个蛋白斑点表达有差异,其中29个蛋白表达上调, 12个蛋白表达下调。对其中35个差异蛋白斑点进行MALDI-TOF-MS分析后,鉴定出了13种可能的差异表达蛋白。通过以上实验可以得出如下结论:1.通过逆转录病毒载体基因转移技术成功构建了能稳定表达BCR/ABL融合蛋白的小鼠BaF3-P210转化细胞株;该细胞株具有增殖能力增强、细胞周期进程加速和对STI571敏感的恶性表型特征。2.进一步通过彗星实验建立了BaF3-P210细胞和BaF3-MIGR1细胞的DNA损伤模型,并发现BCR/ABL融合蛋白可增强BaF3-P210细胞的DNA损伤后修复能力。3.运用比较蛋白质组学技术研究发现,两组细胞经H2O2处理后,BaF3-P210细胞内发生了广泛而复杂的蛋白表达的改变。鉴定出的13个差异蛋白质分别涉及到了DNA损伤修复相关的蛋白、细胞周期调控相关蛋白、细胞凋亡相关蛋白、细胞增殖相关蛋白、细胞能量代谢相关蛋白、信号转导相关蛋白等。综上所述,本研究以小鼠BaF3-P210转化细胞株为模型,选择H2O2为细胞DNA损伤的处理因素,运用比较蛋白质组学技术筛选到了若干受BCR/ABL融合蛋白影响的包括DNA损伤修复相关蛋白在内的差异蛋白,为进一步阐明受BCR/ABL融合蛋白调控的信号转导途径及探讨BCR/ABL融合蛋白对DNA损伤修复功能的影响奠定了基础,并为寻找CML新的治疗靶点提供了线索。
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标签：慢性粒细胞白血病论文; 融合蛋白论文; 损伤论文; 修复论文; 蛋白质组学论文;