论文摘要
实现抗癌肿瘤药物的主动靶向,一直是现代药剂学研究领域中的重要任务。本文以抗肿瘤药物紫杉醇（paclitaxel,PTX）为模型药物,将薄膜分散法、微孔滤膜挤出技术和导向化合物组装技术相结合,制备了整合素配体修饰的长循环脂质体（sterically stabilizedliposome,SSL）,以期通过靶向肿瘤细胞和肿瘤新生血管中过度表达的整合素受体,增加药物向上述细胞的转运,达到特异性地治疗肿瘤的目的。首先,通过计算机辅助分子模拟试验对三种小肽配体精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid,RGD）,甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（glycine-arginine-glycine-aspartic acid-serine,GRGDS）和甘氨酸-半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸-丝氨酸（glycine-cystine-arginine-glycine-aspartic acid-cystine-serine,GCRGDCS）和常见整合素受体αvβ3,α5β1及αvβ5的特异性结合方式进行分析比较,结果发现通过适当改变氨基酸序列可以有效改变含RGD序列配体与受体结合的能力。将RGD、GRGDS和GCRGDCS等导向化合物采用活泼酯法与DSPE-PEG2000-NHS进行化学偶联,制备得到三种导向化合物(DSPE-PEG2000-RGD,DSPE-PEG2000-GRGDS,DSPE-PEG2000-GCRGDCS),并采用MALDI-TOF质谱方法进行结构验证,通过荧光分光光度法计算出合成产物中DSPE-PEG2000-RGD,DSPE-PEG2000-GRGDS,DSPE-PEG2000-GCRGDCS的含量分别为46.99%,43.07%和31.57%。采用薄膜分散法制备包载紫杉醇的靶向SSL。将导向化合物DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-RGD、DSPE-PEG2000-GRGDS和DSPE-PEG2000-GCRGDCS组装至紫杉醇脂质体上,得到SSL-PTX,RGD-SSL-PTX,GRGDS-SSL-PTX和GCRGDCS-SSL-PTX,并对其包封率、粒径、外观形态和体外释放率等性质进行了考察。激光粒度测定仪测得脂质体平均粒径分别为115.5 nm、117.3 nm、117.5 nm和121.2 nm。冰冻蚀刻透射电镜观察结果表明,脂质体外观基本圆整且分散均匀;包封率分别为100.14%、97.94%、96.97%和94.82%。体外释放结果表明,各种脂质体在37℃磷酸盐缓冲液（含0.1%Tween 80,pH7.4）中,8 h内分别释放了59.99%、55.43%、61.51%和61.13%的紫杉醇。采用人卵巢癌SKOV-3细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞进行细胞水平的靶向性评价。细胞粘附试验发现,在脂材量低于0.2μmol/孔时,粘附性具有浓度依赖性,细胞对导向化合物存在特异性粘附,对SKOV-3细胞,RGD配体的粘附性最强;而对MDA-MB-231细胞,GCRGDCS的粘附性最强。用荧光物质Rhod-PE标记脂质体后,通过流式细胞试验和激光共聚焦试验评价SKOV-3和MDA-MB-231细胞对各种脂质体的粘附和摄取。流式细胞试验发现,将脂质体与细胞共同孵育1 h后,SKOV-3细胞对RGD-SSL、GRGDS-SSL以及GCRGDCS-SSL的结合及摄取量依次增加至SSL的6.31、3.85和5.82倍;MDA-MB-231细胞对上述制剂的结合及摄取量增加至6.18、2.23和14.40倍。激光共聚焦试验结果表明,细胞与各组脂质体共同孵育1、2、4 h后,胞浆内的红色荧光强度随时间增加均有不同程度地增强;在各时间点,RGD-SSL、GRGDS-SSL以及GCRGDCS-SSL的荧光强度均强于SSL;结果与流式细胞分析试验结果一致。体外细胞毒试验（SRB法）结果表明经RGD序列肽配体修饰后的*RGD*-SSL-PTX较SSL-PTX细胞毒性均显著增强,毒性增强的能力和细胞粘附能力呈正相关。细胞凋亡试验证明,RGD序列肽配体的修饰可以促进紫杉醇诱导的凋亡,但并不改变凋亡周期。裸鼠体内药效学结果表明,以荷SKOV-3人移植瘤裸鼠为动物模型,体外细胞毒作用最强的脂质体制剂RGD-SSL-PTX的治疗作用显著强于市售紫杉醇制剂Taxol?（P<0.01）,表现出良好的体内外相关性;但以荷MDA-MB-231人移植瘤裸鼠为模型时,体外细胞毒作用最强的脂质体制剂GCRGDCS-SSL-PTX虽有疗效强于Taxol?的趋势,但二者无显著性差异,未表现出良好的体内外相关性。综上所述,以RGD小肽序列修饰的SSL作为抗癌药物的载体,能够显著提高肿瘤细胞对药物的摄取,增加细胞毒性,达到预期目的,但体内药效结果还需要进一步证实。