人免疫缺陷病毒Ⅰ型可以被改造的核酶RNaseP抑制及其与人巨细胞病毒的共感染研究

论文摘要

人免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）被认为是引起人获得性免疫缺陷综合症（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS）的最原始病原体,它是一种感染人体免疫系统细胞的逆转录病毒。本文主要研究核酶RNase P对HIV感染复制的影响和HIV与HCMV共感染这两方面的内容。使用一种体外筛选程序,我们已经筛选到一系列核酶RNase P的突变体,它们在体外可以高效的切割mRNA序列。在本研究中,我们选择了一个突变体——它针对HIV-1的RNA序列位于基因tat区域内。这个突变体核酶在体外切割tat RNA序列的效率比野生型核酶高20倍。这个核酶RNase P突变体的催化活性RNA来源于大肠杆菌,83位和340位核苷酸发生了突变（G83→U83，G340→A340），我们的实验结果第一次直接证明了这种组合突变提高了核酶切割HIV-1的RNA序列的活性。而且,在细胞内,这种突变体核酶比野生型核酶更有效的降低了HIV-1核心蛋白p24的表达和细胞内病毒RNA的水平。在稳定表达这种突变体核酶的细胞内,病毒RNA的水平下降了90%,病毒的生长水平下降了150倍；而在没有表达核酶或者表达催化活性位点失去活力的核酶的细胞内,病毒RNA的水平下降不到10%。因此,我们认为基因工程改造的核酶突变体可以有效的抑制HIV的感染。这些实验结果也表明经过基因工程改造的核酶RNase P在抗HIV方面具有潜在的应用价值。利用免疫共沉淀方法,验证由酵母双杂交筛选到的7个HIV病毒蛋白和7个HCMV病毒蛋白之间的12对相互作用,得到两对阳性结果,分别是tat-RLl和Nef-RLl。通过双荧光报告基因检测,我们发现RL1和tat以及RL1和Nef之间的相互作用并不影响HIV的LTR序列的转录活性。而RL1与pNL4-3. Luc. R-E-和pVSV-G·一起瞬时共转进293T细胞时,随着RL1量的增加,细胞培养基中HIV-1核心蛋白p24的表达量递增。我们通过酵母双杂交方法,筛选到与RL1相互作用的宿主细胞因子hnRNPK,免疫共沉淀和间接免疫荧光检测也证明它们之间可以相互作用；而文献报道hnRNPK调节HIV-1的tat/rev外显子3的剪切过程,对HIV-1有一定的抑制作用。此外,RL1和hnRNPK一起瞬时共转进293T细胞时,hnRNPK的表达量会随着加入RL1的量增加而递减。所以,在HIV和HCMV共感染时,我们推测HCMV可以通过RL1作用于hnRNPK促进HIV-1的复制。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 人免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）
• 1.1.1 人免疫缺陷病毒Ⅰ型简介
• 1.1.2 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型反式激活因子tat
• 1.1.3 HIV-1感染的危害与治疗
• 1.2 人巨细胞病毒（HCMV）
• 1.2.1 人巨细胞病毒的简介
• 1.2.2 人巨细胞病毒的感染复制周期
• 1.2.3 人巨细胞病毒的基因表达
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验中使用的基本仪器、设备
• 2.2 基本实验试剂
• 2.3 常规分子克隆实验技术
• 2.3.1 大肠杆菌DH5α化转感受态细胞的制备
• 2.3.2 大肠杆菌DH5α电转感受态的制备
• 2.3.3 大肠杆菌DH5α感受态的使用
• 2.3.4 SDS碱裂解法小量抽提质粒DNA
• 2.3.5 Northern Blot实验
• 2.3.6 PCR和限制性酶切
• 2.3.7 定点突变PCR
• 2.4 酵母双杂交系列实验
• 2.4.1 cDNA文库的滴定和扩增
• 2.4.2 酵母双杂交所用培养基
• 2.4.3 酵母感受态的制备以及酵母转化
• 2.4.4 酵母质粒提取
• 2.4.5 酵母双杂交筛选文库
• 2.4.6 X-gal显色实验
• 2.5 细胞水平实验
• 2.5.1 细胞培养基及试剂
• 2.5.2 细胞培养（以HFF细胞为例）
• 2.5.3 磷酸钙法转染细胞（以293T细胞为例）
• 2.5.4 脂质体法转染细胞（以Lipofectine2000转染Hela细胞为例）
• 2.6 体外蛋白质检测实验
• 2.6.1 PAGE电泳和Western Blot检测
• 2.6.2 免疫共沉淀实验
• 2.6.3 间接免疫荧光实验
• 2.7 病毒水平实验
• 2.7.1 感染HFF细胞、扩增HCMV
• 2.7.2 测定HCMV的病毒滴度
• 第三章 基因工程改造的核酶RNase P可以有效抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型的复制
• 3.1 概述
• 3.2 实验过程和结果
• 3.2.1 核酶RNase P的构建以及其在体外切割HIV-1的tat基因RNA序列的特性研究
• 3.2.2 人细胞内瞬时表达核酶RNase P抑制HIV-1的基因表达和复制
• 3.2.3 人细胞内稳定表达核酶RNase P抑制HIV-1病毒的产生
• 3.3 分析与讨论
• 第四章 人巨细胞病毒和人免疫缺陷病毒Ⅰ型间蛋白相互作用的研究
• 4.1 概述
• 4.2 实验过程和结果
• 4.2.1 HIV-1和HCMV病毒蛋白相互作用的Co-IP验证
• 4.2.2 HCMV病毒蛋白RL1相关的研究
• 4.2.3 HCMV病毒蛋白RL1与HIV-1的Nef蛋白和tat蛋白相互作用对LTR转录活性的影响
• 4.2.4 HCMV病毒蛋白RL1与宿主蛋白hnRNPK相互作用的验证
• 4.2.5 HCMV病毒蛋白RL1与宿主蛋白hnRNPK相互作用对HIV-1基因表达的影响
• 4.3 分析与讨论
• 参考文献
• 攻博期间已发表或正在撰写的论文
• 致谢