性腺激素对山羊子宫内膜细胞IL-18分泌表达的影响

论文摘要

子宫内膜与呼吸道、胃肠道黏膜类似构成了机体的第一道防线，是机体黏膜免疫的一个重要组成部分。性腺激素在胚胎附植、妊娠建立和子宫内膜细胞的生长和分泌活性中都具有重要的调节作用。白细胞介素-18（IL-18）是近年来新发现的一种多效促炎性细胞因子，其在人、小鼠等的子宫内膜细胞、单核细胞和巨噬细胞中均有表达。现已证明IL-18是一种旁分泌细胞因子，在调节子宫内膜的生理功能、调控母—胎界面的免疫耐受、正常妊娠的维持、胚胎的附植过程起着关键性的作用，而关于性腺激素对子宫内膜细胞IL-18分泌表达调节作用方面的研究报道较少。为了探究性腺激素作用下山羊子宫内膜上皮细胞（EEC）中IL-18的分泌表达活性，以及子宫内膜基质细胞（ESC）对其分泌表达的调节作用，本试验通过套皿技术，利用永生化山羊EEC与ESC构建体外细胞复层模型，采用ELISA、Western blot、半定量RT-PCR和细胞免疫化学方法，检测和分析了E2和/或P4对EEC中IL-18分泌表达的调节作用以及ESC对该作用的影响，获得以下结果：1. ELISA检测表明：性腺激素P4单独或与E2联合作用极显著增强单独培养EEC中IL-18的分泌水平（P<0.01），而E2单独作用无明显影响；在EEC与ESC套皿共培养体系中，E2单独处理或与P4共同作用显著抑制EEC培养上清中IL-18的分泌水平（P<0.05），而P4单独作用没有明显影响。未进行激素处理时，与ESC共培养EEC中IL-18的分泌水平显著高于单独培养EEC中IL-18的分泌水平，免疫细胞化学检测也得到了相似的结果。Western blot检测表明，EEC中分泌表达IL-18主要以分子量为18.3kDa大小的具有生物学活性的形式存在。2.半定量RT-PCR分析表明：单独添加E2可显著增强单独培养EEC中IL-18mRNA的表达水平（P<0.05），P4单独或与E2联合作用则进一步增强其分泌活性（P<0.01）；在EEC与ESC上清液共培养体系中，P4单独处理或与E2联合作用可以极显著抑制EEC中IL-18mRNA的表达水平（P<0.01），E2单独添加对EEC中IL-18mRNA的表达水平影响不显著。在未进行激素处理时，与ESC共培养EEC中IL-18mRNA的表达水平显著高于单独培养EEC。提示性腺激素和ESC在转录水平即可调节EEC中IL-18的表达水平。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 细胞共培养技术及其应用的研究进展
• 1.1 细胞共培养技术的研究进展
• 1.1.1 基于微影图案基质的共培养体系
• 1.1.2 基于软微影术的共培养体系
• 1.1.3 基于可调表面的共培养体系
• 1.1.4 基于双向电泳技术的共培养体系
• 1.1.5 基于机械可配置设备的共培养体系
• 1.1.6 Transwell小室共培养体系
• 1.1.7 3D共培养体系
• 1.2 共培养体系在细胞—细胞相互作用研究中的应用
• 1.2.1 基于肝细胞的共培养体系
• 1.2.2 基于纤维细胞的共培养体系
• 1.2.3 基于神经细胞的共培养体系
• 1.2.4 基于三种或更多细胞类型的共培养体系
• 1.3 细胞共培养体系在临床研究中的应用
• 1.3.1 细胞共培养在胚胎发育中的应用
• 1.3.2 细胞共培养在组织工程中的应用
• 1.3.3 细胞共培养在肿瘤机理研究中的应用
• 1.3.4 细胞共培养在子宫内膜异位症研究中的应用
• 第二章 白细胞介素-18 的研究进展
• 2.1 IL-18的结构概述
• 2.2 IL-18的生物学功能概述
• 2.3 IL-18在繁殖生物学中的研究进展
• 2.3.1 IL-18与胚胎附植和妊娠建立
• 2.3.2 IL-18与子宫内膜异位症
• 2.3.3 IL-18与复发性流产
• 试验部分
• 第三章 性腺激素对山羊子宫内膜上皮细胞 IL-18 蛋白分泌表达的影响
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器与设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 子宫内膜细胞悬液的制备
• 3.2.2 性腺激素作用下山羊 EEC 的体外培养
• 3.2.3 性腺激素作用下山羊 ESC 和 EEC 套皿共培养
• 3.2.4 细胞总蛋白的提取
• 3.2.5 山羊EEC中IL-18的SDS-PAG 凝胶电泳
• 3.2.6 山羊EEC中IL-18的Western blot检测
• 3.2.7 山羊EEC中IL-18的细胞免疫化学检测
• 3.2.8 数据统计与分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 性腺激素对 EEC IL-18 分泌表达的影响
• 3.3.2 山羊 ESC 对性腺激素作用下 EEC IL-18 分泌表达的影响
• 3.3.3 EEC中IL-18的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.3.4 EEC中IL-18的Western blot检测
• 3.3.5 EEC中IL-18的细胞免疫化学检测
• 3.4 讨论
• 3.4.1 性腺激素对EEC IL-18分泌表达的影响
• 3.4.2 山羊ESC对性激素作用下EEC IL-18分泌表达的影响
• 3.4.3 子宫内膜上皮细胞表达IL-18蛋白的意义
• 3.5 小结
• 第四章 性腺激素对山羊子宫内膜上皮细胞IL-18 mRNA表达水平的影响
• 4.1 材料
• 4.1.1 细胞
• 4.1.2 主要仪器
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 方法
• 4.2.1 性腺激素作用下山羊 EEC 的体外培养
• 4.2.2 性腺激素作用下山羊 EEC 和 ESC 上清共培养
• 4.2.3 细胞总RNA的提取
• 4.2.4 IL-18 mRNA反转录
• 4.2.5 PCR产物扩增
• 4.2.6 数据统计与分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 IL-18 mRNA基因 PCR 扩增产物的鉴定
• 4.3.2 性腺激素对EEC IL-18 mRNA表达水平的影响
• 4.3.3 山 ESC对性腺激素作用下EEC IL-18 mRNA表达水平的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 性腺激素对EEC IL-18 mRNA表达水平的影响
• 4.4.2 山羊ESC对性激素作用下EEC IL-18 mRNA表达水平的影响
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介