乙烯对麦冬光合作用的影响及相关基因的克隆

论文摘要

乙烯（ethylene,ETH）在植物生长发育过程中具有重要的生理作用。本研究的目的是在分析乙烯（ETH）对麦冬（Ophiopogon japonicus）光合作用影响的基础上,利用SSH等分子生物学实验技术,从麦冬中克隆与植物衰老相关的基因,为培育绿期长的草坪草新品种奠定基础。通过测定麦冬的光响应曲线和CO2响应曲线得知麦冬的光饱和点在为500μmol·m-2·s-1,光补偿点为10μmol·m-2·s-1,CO2的饱和点为1200μmol·m-2·s-1,CO2补偿点为20μmol·m-2·s-1。乙烯可明显抑制麦冬的净光合速率,使其随处理时间的延长呈下降趋势,乙烯利各浓度间、处理时间之间差异极显著,即随着处理浓度的增加和处理时间的延长,麦冬净光合速率迅速地降低。在乙烯利不同浓度和时间的胁迫下,Fo、Fv/Fm、Fv’/Fm’、ΦPSⅡ、qP、ETR等荧光参数逐渐下降,NPQ逐渐升高,说明乙烯利在植物体内不断分解释放出乙烯,对光系统Ⅱ结构及光系统Ⅱ的光合电子传递链有较大的影响。为进一步从分子水平探明乙烯对麦冬光合作用的影响,通过SSH方法,以0.5g/L乙烯利处理6h的麦冬一年生叶片的cDNA为Tester,对照为Driver,构建了一个含有576个克隆的差减cDNA文库,差异片段大小在100～1500bp之间。通过斑点杂交,从576个克隆中筛选出259个阳性克隆,经测序分析,最终得到237条EST序列,经BLASTx分析,发现有16条EST序列在GenBank中没有找同源序列,可能代表新基因;74条EST序列在数据库中检索到同源性序列,但其功能尚不清楚;147条序列在GenBank中能找到与其它物种已知基因部分区域的同源序列,同源性为25～100%。在建立全长cDNA文库的基础上,根据获得的EST序列设计引物,从全长cDNA文库中筛选出叶绿素结合蛋白（CAB）基因和一个编码未知蛋白（UNP）基因,经测序分析:CAB基因的全长序列为1055bp,其编码区为18～1812之间,编码区为795bp,5’UTR为1～17bp,包含17个bp;3’UTR为813～11055bp,包含243bp。同源性比较结果为:麦冬CAB基因与二球悬铃木(（Platanus xacerifolia）、水稻（Oryza sativa）、烟草（Nicotiana tabacum）等植物有86%～73%的同源性。系统发育分析:其与龙舌兰（Agave tequilana）CAB基因亲缘关系较近,与烟草CAB基因最远。其编码的蛋白质由264个氨基酸组成,分子量为28kDa,理论等电点pI为5.29,Asp+Glu为26个,Arg+Lys为21个,分子组成为C1272H1943N327O367S10。CAB基因编码蛋白的疏水性的最大值为2.222、最小值为-1.844。三维结构具有3个α螺旋结构。UNP基因全长序列为916bp,其编码区为55-762之间,编码区为708bp,5’UTR为1～54bp,包含54bp;3’UTR为763-～916bp,包含154bp。BLAST分析:与非冗余核苷酸数据库（nr）、STS、GSS、HTGS比对,未发现相似性高的同源序列;与EST数据库比对,发现与鹅掌楸（Liriodendron tulipifera）花芽cDNA文库中的四条EST序列同源性为73%;随后又将这一序列与非冗余蛋白数据库（nr）比对分析,其与葡萄（Vitis vinifera）、黑杨（Populus trichocarpa）等植物有37～54%同源性。系统发育分析:麦冬UNP编码蛋白与葡萄、黑杨、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等UNP编码蛋白亲缘关系较近,和其他植物之间的亲缘关系比较远。其编码的蛋白质由235个氨基酸组成,分子量为27kDa,理论等电点pI为6.47,Asp+Glu为37个,Arg+Lys为36个,原子组成为C1188H1871N333O361S13。UNP基因编码蛋白的疏水性最大值为1.511、最小值为-3.267。以pCAMBIA1303为基础,引入BamHⅠ和KpnⅠ的酶切位点,构建了pCAMBIA1303-CAB（+）、pCAMBIA1303-CAB（-）、pCAMBIA1303-UNP（+）、pCAMNIA1303-UNP（-）等四种植物表达载体,并导入到土壤农杆菌LBA4404中。以pET-30a（+）为基础,构建了原核表达载体pET-30a-CAB和pET-30-UNP,转化到大肠杆菌BL21中,经不同浓度IPTG分别诱导0、1、2、3、4和5h后,SDS-PAGE电泳分析结果为:在IPTG的诱导下,外源基因CAB与UNP都能在大肠杆菌BL21中表达,CAB基因表达的蛋白的电泳条带在28kDa左右,UNP基因表达的蛋白的电泳条带在27kDa左右,理论推测结果相一致。在一定的IPTG浓度和诱导时间的范围内,随着浓度和时间的延长,CAB与UNP基因表达的蛋白量增大。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 综述
• 1.1 乙烯的研究进展
• 1.1.1 乙烯的生物合成
• 1.1.1.1 乙烯的生物合成途径
• 1.1.1.2 乙烯生物合成的关键酶
• 1.1.2 乙烯的信号转导
• 1.1.2.1 乙烯反应突变体
• 1.1.2.2 乙烯受体蛋白
• 1.1.2.3 乙烯的信号转导
• 1.1.3 乙烯的生理作用及应用
• 1.1.3.1 改变生长习性
• 1.1.3.2 促进果实成熟
• 1.1.3.3 促进叶片衰老和器官脱落
• 1.1.3.4 诱导不定根的发生和植株分蘖
• 1.1.3.5 促进次生物质的合成与排出
• 1.1.3.6 增加黄瓜雌花
• 1.2 麦冬的研究进展
• 1.2.1 遗传多样性研究
• 1.2.2 核型分析
• 1.2.3 耐盐性研究
• 1.2.4 耐荫性研究
• 1.3 差异表达基因克隆的常见方法
• 1.3.1 差异显示技术（DDRT-PCR）
• 1.3.2 代表性差异分析法（RDA）
• 1.3.3 基因芯片
• 1.3.4 抑制性差减杂交（SSH）技术
• 1.3.4.1 SSH的基本原理
• 1.3.4.2 SSH技术的主要过程
• 1.3.4.3 SSH技术的特点
• 1.3.4.4 SSH在动植物上的应用
• 1.4 本研究的意义、内容与技术路线
• 1.4.1 目的与意义
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 技术路线
• 2 乙烯对麦冬光合作用的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 麦冬光响应曲线的测定
• 2响应曲线的测定'>2.1.2.2 麦冬CO₂响应曲线的测定
• 2.1.2.3 乙烯对麦冬光合速率影响的测定
• 2.1.2.4 乙烯对麦冬荧光特性影响的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 麦冬的光响应曲线
• 2响应曲线'>2.2.2 麦冬的CO₂响应曲线
• 2.2.3 乙烯对麦冬光合速率的影响
• 2.2.4 乙烯对麦冬各荧光参数影响的测定
• 2.2.4.1 乙烯对麦冬最小初始荧光Fo的影响
• 2.2.4.2 乙烯对麦冬光化学量子效率Fv/Fm的影响
• 2.2.4.3 乙烯对麦冬Fv'/Fm'的影响
• 2.2.4.4 乙烯对光系统PSⅡ实际光化学量子产量的影响
• 2.2.4.5 乙烯对麦冬光化学猝灭系数的影响
• 2.2.4.6 乙烯对麦冬NPQ的影响
• 2.2.4.7 乙烯对麦冬ETR的影响
• 2.3 结论与讨论
• 2.3.1 植物激素对光合作用的影响
• 2.3.2 生理节奏对光合速率的影响
• 2.3.3 生长发育
• 3 麦冬乙烯诱导表达差减cDNA文库的构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 材料培养与处理
• 3.1.1.3 实验试剂及测序
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 总RNA的提取和纯化
• 3.1.2.2 Poly（A）RNA的分离
• 3.1.2.3 抑制差减杂交
• 3.1.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.2.5 正向差减cDNA的克隆
• 3.1.2.6 差异筛选cDNA文库
• 3.1.2.7 阳性克隆的测序和序列分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 麦冬RNA的提取及纯化
• 3.2.2 麦冬mRNA的分离
• 3.2.3 差减cDNA文库的构建
• 3.2.3.1 酶切与接头连接效率分析
• 3.2.3.2 差减效率分析
• 3.2.3.3 差减cDNA文库的构建
• 3.2.4 差异筛选差减cDNA文库
• 3.2.4.1 探针的标记效率
• 3.2.4.2 斑点杂交
• 3.2.5 阳性克隆的测序与序列分析
• 3.2.5.1 阳性克隆的测序
• 3.2.5.2 EST序列分析
• 3.3 结论与讨论
• 3.3.1 植物总RNA的提取与纯化
• 3.3.1.1 防止RNA酶的污染
• 3.3.1.2 提取方法与试剂的选择
• 3.3.1.3 多糖与杂蛋白的去除
• 3.3.1.4 RNA沉淀剂的选择
• 3.3.2 mRNA的分离
• 3.3.3 差减cDNA文库的建立
• 3.3.4 探针的标记
• 3.3.5 SSH的应用
• 4 叶绿素结合蛋白基因与未知蛋白基因的克隆
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.1.1 植物材料
• 4.1.1.2 材料培养与处理
• 4.1.1.3 实验试剂
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 麦冬总RNA的提取与纯化
• +RNA的分离'>4.1.2.2 Poly（A）⁺RNA的分离
• 4.1.2.3 cDNA文库的构建
• 4.1.2.4 CAB与UNP基因的获得
• 4.1.2.5 CAB与UNP基因的序列分析与功能预测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 全长cDNA文库的构建
• 4.2.2 CAB基因与UNP基因全长序列的获得
• 4.2.3 CAB基因序列分析与功能预测
• 4.2.3.1 CAB基因开放阅读框（ORF）分析
• 4.2.3.2 CAB基因BLAST分析
• 4.2.3.3 CAB基因系统发育分析
• 4.2.3.4 CAB基因编码蛋白的理化性质分析
• 4.2.3.5 CAB基因编码蛋白的疏水性分析
• 4.2.3.6 CAB基因编码蛋白的结构预测
• 4.2.4 UNP基因的序列分析与功能预测
• 4.2.4.1 UNP基因开放阅读框（ORF）分析
• 4.2.4.2 UNP基因BLAST分析
• 4.2.4.3 UNP基因系统发育分析
• 4.2.4.4 UNP基因编码蛋白的理化性质分析
• 4.2.4.5 UNP基因编码蛋白的疏水性分析
• 4.3 讨论
• 5 表达载体构建与原核表达
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 限制性内切酶与常用生化试剂
• 5.1.1.2 菌种和质粒
• 5.1.2 方法
• 5.1.2.1 正义、反义植物表达载体的构建
• 5.1.2.2 表达载体导入农杆菌LBA4404
• 5.1.2.3 原核表达载体构建
• 5.1.2.4 融合蛋白的诱导表达
• 5.1.2.5 SDS-PAGE所需试剂的配制
• 5.1.2.6 SDS-PAGE电泳
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 植物表达载体构建
• 5.2.1.1 酶切位点的引入
• 5.2.1.2 正、反义载体的构建
• 5.2.1.3 正、反义表达载体导入农杆菌
• 5.2.2 原核表达载体构建
• 5.2.3 SDS-PAGE电泳
• 5.3 结论与讨论
• 6 结论与展望
• 6.1 乙烯对麦光合作用的影响
• 2响应曲线'>6.1.1 麦冬的光响应曲线与CO₂响应曲线
• 6.1.2 乙烯对麦冬光合速率的影响
• 6.1.3 乙烯对麦冬各荧光参数影响
• 6.2 差减cDNA文库的构建
• 6.2.1 麦冬总RNA的提取与mRNA的分离
• 6.2.2 差减cDNA文库的构建
• 6.2.3 差异筛选差减cDNA文库
• 6.3 叶绿素A/B结合蛋白（CAB）基因的获得
• 6.3.1 CAB基因的核甘酸序列分析
• 6.3.2 CAB基因编码蛋白的分析及预测
• 6.4 UNP基因的序列分析与功能预测
• 6.4.1 UNP基因开放阅读框（ORF）分析
• 6.4.2 UNP基因编码蛋白的分析
• 6.5 表达载体构建与原核表达分析
• 6.5.1 植物表达载体构建
• 6.5.2 原核表达
• 6.6 展望
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 附录Ⅱ
• 附录Ⅲ
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢