对虾白斑综合征病毒LAMP-LFD检测方法的建立

论文摘要

本研究建立了WSSV的环介导等温扩增的快速检测方法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）的检测方法,并将该法与研制的FITC核酸检测侧向层析试纸（FITC nucleic acid detection lateral flow dipstick, FITC-LFD）相结合建立了更为灵敏、特异、有效、更适合实地检测的WSSV检测方法LAMP-LFD。参照GenBank上发表的WSSV基因组序列中的保守的囊膜蛋白基因VP28基因序列,设计两条特异性的引物对其进行PCR扩增,并将产物与pDM-19T连接构建重组载体pDMT-VP28;依照LAMP技术原理,利用Primer Explorer V4设计了四条引物利用构建的VP28重组载体为标准模板,优化建立了WSSV的LAMP检测方法；而后对WSSV-DNA为模板进行十倍系列稀释,并以其为模板对LAMP与nested-PCR进行了检测限的比较。结果显示,WSSV-LAMP最佳反应温度为65℃、反应时间为60min; LAMP对WSSV-DNA的最低检测限为10拷贝/μL,而nested-PCR为100拷贝/μL,敏感性显著显著高于nested-PCR。利用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）与蛋白质亲和的作用,将其与BSA、OVA禺联；以FITC-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,并对血清敏感性和特异性进行鉴定以确定细胞融合备用鼠。结果显示：1号小鼠pAb效价最高,对FITC的半数抑制浓度最低,选择用1号小鼠进行融合。利用杂交瘤细胞技术制备FITC单克隆抗体（Monoclonal antibody, mAb）经筛选得到6株高度敏感特异的杂交瘤细胞；以1B11体内诱生腹水制备单克隆抗体,制备腹水效价为1/640000,半数抑制浓度IC50为7.812ng/mL,获得了效价高、特异性强的FITC-mAb。柠檬酸三钠还原法制备胶体金并将其按3μL/条的量喷至玻璃纤维塑薄膜上以0.5mg/mL的亲和素和1mg/mL的山羊抗鼠IgG按照1.2μL/cm得量分别标记NC膜上的检测线（T线）和控制线（C线）；组装FITC核酸检测侧向层析试纸（FITC-LFD）。利用带有生物素的引物FIP进行LAMP扩增,在反应完成前加入FITC的探针进行杂交5min,终止反应后以试纸检测,建立WSSV-LAMP-LFD检测方法；根据该试纸检测不同条件下的扩增产物得到的结果,优化得到最适检测用LAMP扩增条件；而后对WSSV-DNA为模板进行十倍系列稀释,并以其为模板进行WSSV-LAMP-LFD检测。结果显示：FITC-LFD的最适检测用LAMP扩增条件为64℃,50min；该方法对WSSV-DNA的最低检测限为10拷贝/μL,与LAMP检测方法灵敏度相同。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 病毒的命名及分类
• 1.2 WSSV传播方式及寄主范围
• 1.3 WSSV形态和超微结构
• 1.3.1 主要的囊膜蛋白
• 1.3.2 主要的核糖体蛋白
• 1.4 WSSV的基因组构成
• 1.4.1 病毒基因表达的时序性基因
• 1.4.2 潜伏期相关基因
• 1.4.3 抗凋亡基因
• 1.4.4 WSSV最高表达量的基因
• 1.5 WSSV的控制和诊断方法
• 1.5.1 WSSV的控制措施
• 1.5.2 WSSV的检测方法
• 1.6 环介导等温扩增技术（LAMP）及其水生物病原体诊断中的应用
• 1.6.1 简介
• 1.6.2 LAMP的原理
• 1.6.3 LAMP产物的可视化判定
• 1.6.4 LAMP在病毒中的应用
• 1.6.5 基于LAMP的检测方法的优势和存在的问题
• 1.6.6 LAMP在对虾疾病中的应用
• 1.7 本章小结
• 第二章 对虾白斑综合征病毒LAMP检测方法的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 质粒、菌种和试剂
• 2.1.2 主要设备仪器
• 2.1.3 主要液体试剂
• 2.1.4 WSSV-VP28基因的扩增
• 2.1.5 pDMT-VP28重组质粒的构建
• 2.1.6 pDMT-VP28重组质粒的扩增及提取
• 2.1.7 LAMP及nested-PCR引物的设计
• 2.1.8 LAMP反应的体系建立及条件的优化
• 2.1.9 Nested-PCR反应的体系
• 2.1.10 WSSV-DNA的LAMP与nested-PCR检测限的测定及对比
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 pDMT-VP28重组质粒的鉴定结果
• 2.2.2 LAMP检测WSSV的条件优化
• 2.2.3 LAMP检测WSSV的可视化结果
• 2.2.4 LAMP和nest-PCR的检测限的测定与对比
• 2.3 讨论
• 第三章 抗FITC单克隆抗体的制备
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试剂与溶液
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 实验所需动物和细胞
• 3.1.4 FITC人工抗原的合成
• 3.1.5 FITC人工抗原鉴定
• 3.1.6 抗FITC-pAb制备及鉴定
• 3.1.7 抗FITC杂交瘤细胞系的建立
• 3.1.8 抗FITC-mAb的生产
• 3.1.9 抗FITC-mAb的免疫学特性鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 FITC人工抗原鉴定结果
• 3.2.3 抗FITC-pAb的效价及敏感性鉴定结果
• 3.2.4 抗FITC杂交瘤细胞株的建立和筛选结果
• 3.2.5 细胞培养上清、腹水和纯化抗FITC-mAb效价测定结果
• 3.2.6 抗FITC-mAb敏感性的鉴定结果
• 3.3 讨论
• 第四章 FITC核酸检测侧向层析试纸的研制
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试剂、溶液及耗材
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 FITC-LFD的研制
• 4.1.4 LAMP-LFD法检测WSSV方法的建立和检测限的测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 WSSV-LAMP-LFD检测方法的建立及其条件的优化
• 4.2.2 WSSV-LAMP-LFD法检测WSSV检测限测定
• 4.3 讨论
• 第五章 研究总结
• 参考文献
• 附录A: 英文缩略词表（Abbreviations）
• 作者简历
• 致谢