盐生杜氏藻抗盐胁迫生理与NO关系的初步研究

论文摘要

本文从NO的视角对盐生杜氏藻的抗盐胁迫进行了初步的研究,试图找出NO,这种生物学中新的信号分子是否参与了盐生杜氏藻的抗盐胁迫过程。通过不同盐度对盐生杜氏藻生长、光和作用参数影响的研究结果表明,盐生杜氏藻具有很广的适盐范围,在本实验设定的,5‰、10‰、30‰、60‰、100‰、150‰、200‰、250‰和300‰9个盐度组中,盐生杜氏藻在60‰盐度组中细胞生长状况最好,光合作用情况也最好。过高（200‰、250‰和300‰）或过低（5‰和10%0）的盐度,对于盐生杜氏藻都是一种胁迫,影响其细胞分裂生长和光合作用的进行。检测不同盐度下盐生杜氏藻内NO的产生,结果表明盐生杜氏藻在生长过程中会产生NO,相比60‰盐度组,受到胁迫的5‰、10‰、30‰、100‰、150‰、200‰、250‰和300‰盐度组内NO的产量都有所增加,而且胁迫越大,NO的增加量就越大。由此可以说明,NO很有可能参与盐生杜氏藻抗盐胁迫的过程。盐生杜氏藻在受到盐胁迫时,体内会启动抗胁迫反应,常见的抗氧化酶系统开始发挥作用,其酶活性会升高,如SOD （Super Oxide Dismutase,超氧化物歧化酶）和CAT （Catalase,过氧化氢酶）的活性。同时,未得到清除的胁迫产物,如脂质过氧化物MDA （Malondialdehyde,丙二醛）等的产量会升高。不同盐度下,探究NO与SOD、CAT活性以及MDA产量关系的实验结果表明：相比对照组,加入SNP（NO供体）,会降低SOD与CAT活性,同时MDA产量也会降低,而加入c-PTIO （NO吞噬剂）,相比对照组SOD与CAT活性升高,MDA产量也升高。这种现象说明,合适量的外源NO,会对处于胁迫生理中的盐生杜氏藻产生保护作用,参与抵抗盐胁迫生理过程,促使盐生杜氏藻恢复正常的生理活动,这时原先用于抵抗胁迫而启动的SOD和CAT等酶活性开始下降,进而胁迫产生的氧化产物MDA等的含量也开始下降。盐胁迫生理下,NO对盐生杜氏藻的这种保护作用,进一步说明NO参与盐生杜氏藻的抗盐胁迫生理,并起一定的积极作用。本论文研究了盐胁迫生理条件下,盐生杜氏藻内NO产生的途径。在植物体内,NO主要是由两种酶催化产生的,即类NOS （Nitric Oxide Synthase,一氧化氮合酶）和NR （Nitrate Reductase,硝酸还原酶）类。加入L-NAME （NOS（?）抑制剂）和Na2WO4 （NR抑制剂）,相比对照组,均能抑制盐生杜氏藻内NO的产量。这说明,盐生杜氏藻在盐胁迫生理中NO的产生途径很有可能包括类一氧化氮合酶途径和硝酸还原酶途径。研究结果显示,两种酶产生NO的程度是不同的,在低度盐胁迫条件下,NR途径占主导地位。这一结果表明,低等的单细胞藻类具有与高等植物体类似的NO产生机制。在300‰盐度组中,盐生杜氏藻受到很大的盐胁迫,这时类NOS途径比NR途径占优势,说明在高盐胁迫的诱导下类一氧化氮合酶活性被大量诱导。NOS途径更常见于动物和细菌体内,盐胁迫生理中盐生杜氏藻NO产生途径存在类NOS途径的现象表明,低等的海洋单细胞藻类盐生杜氏藻NO的生理代谢途径,存在与动物和细菌类似的机制。盐生杜氏藻生长初期（第Ⅰ生长期）,进入新的生存环境,各种生理条件都不稳定,其抵抗能力较弱,这时候加入SNP的浓度在50μM以上时,均对盐生杜氏藻的生长产生较大的抑制作用。当盐生杜氏藻细胞进入指数生长期（第Ⅱ生长期）时,藻细胞处在旺盛的生长分裂阶段,对外界的抵抗性比较强,这时候加入不同浓度的SNP （10μM、50μM、100μM、150μM）,对藻细胞的分裂生长均没有明显的抑制作用。加入SNP与c-PTIO均未观察到对两种代谢累积物β-胡萝卜素和甘油有明显规律性的促进或抑制作用,这可能是因为β-胡萝卜素和甘油是盐生杜氏藻的次级代谢累积物,盐生杜氏藻在生长到一定阶段才开始大量合成积累,甚至还需要一定的外界刺激条件,而SNP和c-PTIO的作用都是比较短暂的,使得这种短暂的效应对于长期的累积物产量没有明显的影响。NO的信号途径,是一种很复杂的过程,由于NO作用的特殊性,以及NO检测的复杂性,尽管本课题有关NO在盐生杜氏藻中的研究还是初步的,但是,实验结果显示了一定的规律,盐生杜氏藻在受到盐胁迫时,通过硝酸还原酶途径和类一氧化氮合酶途径产生NO,产生的NO很可能参与到盐生杜氏藻抗盐胁迫生理过程,在胁迫过程中对藻细胞起保护作用。但这种保护作用是如何发挥的,NO作为一种信号分子又是如何启动信号传递,启动的是怎样的信号途径等问题,还需要进一步更深入的研究。信号分子NO在低等海藻中的研究,相对比较少,这是一个拓宽NO作用的新领域,具有比较大的研究价值,可以结合现在一些先进分子生物学和生物化学研究手段,从基因蛋白水平开展更深入的探索研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词（Abbreviation）
• 第一章 绪论
• 1.1 信号分子NO
• 1.1.1 NO简介
• 1.1.2 NO的多样性功能
• 1.2 NO在海藻中作用的研究
• 1.3 盐生杜氏藻与NO
• 1.3.1 杜氏藻简介
• 1.3.2 盐生杜氏藻及其耐盐机制
• 1.3.3 海洋微藻中NO的产生途径
• 1.4 盐生杜氏藻中的β-胡萝卜素和甘油
• 1.5 叶绿素荧光分析技术
• 1.6 本项研究的立题依据
• 第二章 盐胁迫下盐生杜氏藻内NO的产生
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要试剂和仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 微藻培养
• 2.3.2 盐胁迫处理
• 2.3.3 叶绿素荧光的测定
• 2.3.4 NO的测定
• 2.3.5 细胞数的测定
• 2.4 实验结果与分析
• 2.4.1 细胞数与680nm吸光度对应的标准曲线
• 2.4.2 不同盐度下盐生杜氏藻的生长曲线
• 2.4.3 叶绿素荧光参数
• 2.4.4 盐胁迫条件下盐生杜氏藻内NO的产生
• 本章小结
• 第三章 NO在盐生杜氏藻抗盐胁迫生理中的作用
• 3.1 实验材料
• 3.2 主要试剂和仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 抗氧化酶活性测定中粗酶液的制备
• 3.3.2 盐胁迫及化学因子的处理
• 3.3.3 SOD活性的测定
• 3.3.4 CAT活性的测定
• 3.3.5 MDA活性的测定
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 NO对SOD活性的影响
• 3.4.2 NO对MDA产量的影响
• 3.4.3 NO对CAT活性的影响
• 3.5 结果分析与讨论
• 本章小结
• 第四章 NO产生途径的初步探讨
• 4.1 实验材料
• 4.2 主要试剂和仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 样品液的制备
• 4.3.2 NO的测定
• 4.3.3 细胞数的测定
• 4.4 实验结果
• 4.5 结果分析与讨论
• 本章小结
• 第五章 NO对盐生杜氏藻生长及代谢物积累的影响
• 5.1 实验材料
• 5.2 主要试剂和仪器
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 β-胡萝卜素含量的测定
• 5.3.2 甘油含量的测定
• 5.3.3 细胞数的测定
• 5.4 实验结果
• 5.4.1 外源NO对盐生杜氏藻细胞生长的影响
• 5.4.2 外源NO对β-胡萝卜素产量的影响
• 5.4.3 外源NO对甘油产量的影响
• 5.5 结果分析与讨论
• 本章小结
• 本文总结及展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表