论文摘要
目前，核移植技术存在很严重的问题，即总效率低、流产率高、克隆动物异常发育等。这些问题可能归因于体细胞的分化程度、处理方法和核移植后重组胚胎的核重新编程不完整等。核的重编程过程大体可分为重组胚核形态的重塑和核基因组的后生遗传修饰。核的重塑是在MPF（成熟促进因子）的作用下完成的，这一过程完成的质量直接关系到核的重编程的正确性、重组胚胎的质量和克隆动物的健康。核的重编程是一个多基因修饰的过程，目前没有明确的生化指标来衡量基因组重编程的程度，一般通过观察核的重塑效果和核移植效率来评估。本试验以卵泡颗粒细胞为供核细胞，以去核的MⅡ卵母细胞为受体进行核移植，通过延长移入核与卵母细胞胞质的互作时间（延迟激活时间）、在胚胎液中添加咖啡因以及传代培养颗粒细胞和不同的同步化处理方式来研究重组胚核的重塑效果和重组胚胎的发育效果，旨在提高重组胚核重编程的能力和改善胚胎的体外生产效率。共分为4个试验，结果如下：试验1：核移植后延迟激活时间对重组胚胎发育效果的影响。将重组胚培养于NCSU-23中，分别培养0h、1.5h、3h和4.5h后，以强度为1.3 KV·cm-1、宽度为80μs、1次电脉冲激活，培养后观察胚胎的卵裂率、4-8细胞比率和8细胞以上胚胎比例，旨在研究延迟激活时间延长MPF对核的作用对胚胎发育的影响。结果显示，重组胚的卵裂率、4-8细胞比率和8细胞以上胚胎比例，0h激活组显著低于1.5h、3h和4.5h激活组的重组胚（P＜0.05），而1.5h、3h和4.5h相比，三者之间差异不显著（P＞0.05），但是3h激活组要高于1.5h和4.5h激活组。表明，延迟激活时间使MPF与重组核作用时间增加对胚胎的发育有促进作用，以延迟3h激活使重组胚胎的发育效果达到最佳。试验2：咖啡因对核移植重组胚胎核的重塑和重组胚发育的影响。本试验包括以下三个方面：（1）观察核移植后PCC形成的过程。核移植胚胎培养于含有或者不含有2.5mM咖啡因的胚胎培养液NCSU-23中，培养0h、1.5h、3h和4.5h后，在室温下用3：1的甲醇乙酸固定48h，再用1％醋酸地衣红染色，镜检，观察核的变化。染色显示，不管在胚胎液中添加或不添加2.5mM咖啡因，重组胚核都首先膨大、然后核膜破裂（NEBD）、最后染色体的凝集（PCC），即核的重塑过程相同。（2）咖啡因对重组胚核重塑的影响。核移植后重组胚分别在含有或者不含有2.5mM咖啡因的NCSU-23中培养。培养0h、1.5h、3h和4.5h后，用地衣红染色观察NEBD和PCC的发生，旨在研究咖啡因对核重塑的影响。结果显示，不含咖啡因组在0h没有NEBD的发生，1.5～4.5hNEBD发生率在11％左右，而含咖啡因组从0h～1.5h，NEBD发生率迅速升高，从1.5h～4.5h迅速降低；不含咖啡因组PCC的发生率0～3h从0迅速升高到37.93％，3～4.5h明显降低，而含咖啡因组PCC的发生率0～3h从0迅速升高到近57.14％，3～4.5h降低，并且在1.5h、3h和4.5h含咖啡因组的PCC发生率显著高于不含咖啡因组（P＜0.05）。表明，核移植后3h是重组胚核重塑完成（即形成PCC）的高峰，但添加咖啡因组显著高于没有添加咖啡因组（57.14％vs37.93％），说明咖啡因加速了重塑的完成，对重组胚核重塑的完成有明显的促进作用。（3）咖啡因对重组胚发育的影响。将重组胚分别培养于含有或不含有2.5mM咖啡因的NCSU-23，观察重组胚的卵裂率、4-8细胞率和8-细胞以上胚胎的比率，旨在研究咖啡因对核移植重组胚的发育的影响。结果显示，卵裂率分别为46.77％（29／62）和39.13％（27／69），两组间没有显著差异（P＞0.05）；而4-8细胞比例分别是30.65％（19／62）和15.94％（11／69），两组间差异显著（P＜0.05）；8-细胞以上胚胎比例分别是12.90％（8／62）和5.8％（4／69），两组间差异显著（P＜0.05）。结果表明，咖啡因虽然对重组胚促卵裂作用不明显，但是对胚胎的早期发育有促进作用。试验3：颗粒细胞的传代培养对核移植胚胎发育的影响。本试验分为三组：Ⅰ组为原代培养；Ⅱ组为传代培养4次；Ⅲ组为传代培养7次。核移植后融合，在显微操作仪下观察“颗粒细胞—卵母细胞”复合体的融合情况，比较“颗粒细胞-卵母细胞”复合体的融合率；培养后观察统计重组胚胎的卵裂率、4-8细胞率和8细胞以上胚胎率，旨在研究传代培养对“颗粒细胞-卵母细胞”复合体的融合能力和胚胎发育能力的影响。结果显示，融合率分别是59.84％（73／122）、61.54％（72／117）、57.14％（68／119），三组之间差异不显著（P＞0.05）；卵裂率分别为45.21％（33／73）、41.67（30／72）、45.59％（31／68），三组之间差异不显著（P＞0.05）；4-8细胞的比例分别为32.88％（24／73）、36.10％（26／72）、32.35％（21／68），三组之间差异不显著（P＞0.05）；发育到8-细胞以上胚胎的比例Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组分别为13.70％（10／73）、11.11％（8／72）和11.76％（8／68），三组之间差异不显著（P＞0.05）。表明，颗粒细胞传代培养对“颗粒细胞—卵母细胞”复合体的融合能力没有影响。试验4：颗粒细胞G0／G1期不同同步化处理方式对核移植胚胎发育效果的影响。利用部分汇合（长满80％）、高度汇合（4天）和血清饥饿（3天）的颗粒细胞作为核供体，融合激活后在显微操作仪下观察“颗粒细胞—卵母细胞”复合体的融合情况，比较“颗粒细胞-卵母细胞”复合体的融合率，并且在培养后观察胚胎的发育效果，以组胚胎的卵裂率、4-8细胞率和8-细胞以上胚胎率为衡量指标，旨在研究不同同步化处理方式对“颗粒细胞-卵母细胞”复合体的融合能力、核的重塑和胚胎发育能力的影响。结果显示，融合率分别为56.91％（70／123）、58.46％（76／130）和55.37％（57／121），三组之间差异不显著（P＞0.05）；卵裂率分别为44.29％（31／70）、46.05％（35／76）和42.10％（24／57），三者之间差异不显著（P＞0.05）；4-8细胞的比例分别是32.86％（23／70）、31.58％（24／76）和35.09％（20／57），三者之间差异不显著（P＞0.05）；8-细胞以上胚胎所占比例分别为10.00％（7／70）、13.16％（10／76）和10.52％（6／57），三者之间差异不显著（P＞0.05）。表明，颗粒细胞的三种同步化处理方式对“颗粒细胞—卵母细胞”复合体的融合能力和重组胚的早期发育能力没有影响。核移植时可以根据实际情况选择恰当的处理方式。综上所述，猪颗粒细胞核移植研究中，延迟激活时间对胚胎的发育有促进作用，以延迟3h激活胚胎发育效果最佳。核移植后，重组核首先膨大，然后发生NEBD，最后PCC的出现，并且培养3h是PCC发生的高峰。但是，添加咖啡因的NCSU-23促进了核的重塑，从而促进了胚胎的发育。PCC发生高峰时间和延迟激活效果最佳时间均为3h，表明核充分重塑之后再对重组胚进行电激活有利于胚胎的发育。对颗粒细胞进行传代培养和G0／G1期不同同步化处理，不影响“颗粒细胞-卵母细胞”复合体的融合能力，并且对其重组胚核的重塑和早期胚胎的发育能力，可以明显简化核移植程序。因此，以重组核的重塑和重组胚早期发育能力为衡量重编程的指标，可以得出，咖啡因对核移植胚胎的重编程有明显的促进作用，而颗粒细胞细胞的传代培养和G0／G1期不同同步化处理方式对重编程没有影响。