烟草（Nicotiana tabacum）中DREB转录因子的克隆和功能分析

论文摘要

干旱、高盐、低温等逆境胁迫是影响植物生长发育和品质形成的主要环境因素。DREB是植物中特有的一类转录因子,在植物的逆境胁迫应答中发挥着非常重要的作用。本研究利用生物化学和分子生物学的手段从普通烟草品种K326 （Nicotiana tobaccum）中分离克隆到新的DREB转录因子基因,对其功能进行了初步探讨,有助于进一步揭示DREB家族的调控机制,为以后利用其改良烟草综合抗逆性提供了研究基础。本论文通过Genome Walking的方法,从烟草中克隆到四个DREB-Like基因,分别命名为NtDREBI、NtDREB2、NtDREB3、NtDREB4。序列分析发现它们具有典型的AP2/EREBP家族结构特征,进化树分析结果表明四个基因均属于DREB亚族,NtDREBI与油菜BnDREB2-1同源性很高,NtDREB2、NtDREB3和NtDREB4与番茄LeCBF1和烟草NtACRE111B同源性较强。ERF/AP2结构域比对发现,NtDREB4在ERF/AP2的第11位氨基酸残基处是Asn,而其它的转录因子在该位则是保守的Asp和Gly。基因表达模式分析表明四个基因都强烈的受冷胁迫诱导,同时NtDREB4还受干旱、高盐和乙烯诱导。酵母单杂交结果显示,NtDREBI能够特异性结合DRE元件并激活下游基因表达; NtDREB2、NtDREB3只能结合DRE元件不具有激活功能;而NtDREB4却不能与DRE元件结合。将NtDREBI与BnDREB2-1,NtDREB1A与AtDREB1A的氨基酸序列进行比对发现,处于转录调控区的第148位氨基酸有所不同,采用定点突变方法进一步研究表明DREB1A类转录因子的第148位氨基酸残基与其邻近氨基酸残基的相互作用对调控转录激活功能起关键作用。利用构建的PDI融合表达系统,通过Ni-NTA提取并纯化了高度可溶的NtDREB-PDI融合蛋白,进行凝胶滞留分析表明: NtDREB2和NtDREB3能够特异性的结合DRE元件,而NtDREB4既不能与DRE元件结合也不能与GCC box元件结合。由于NtDREB4的ERF/AP2结构域的第11位氨基酸残基与其它转录因子有差别,因而通过定点突变和酵母单杂交结果表明ERF/AP2结构域中loop上的第11位的甘氨酸和天冬氨酸对于DREB结合DRE元件及维持ERF/AP2结构域的稳定构象是必需的。

论文目录

• 致谢
• 主要符号对照表
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物在逆境胁迫下的基因表达
• 1.1.1 ABRE 介导的ABA 依赖的信号通路
• 1.1.2 依赖ABA 的信号通路中的其它顺式作用元件
• 1.1.3 在非生物胁迫中的不依赖于ABA 的信号通路
• 1.1.4 胁迫应答反应中不同顺式作用元件介导的信号交叉
• 1.2 AP2/EREBP 类转录因子
• 1.2.1 ERF/AP2 结构域的发现
• 1.2.2 AP2/EREBP 转录因子的结构特征
• 1.2.3 ERF/AP2 结构域的分类
• 1.2.4 ERF/AP2 结构域的起源与进化
• 1.3 DREB 类转录因子及DRE 介导的信号通路
• 1.3.1 DRE 元件及DREB 转录因子
• 1.3.2 受DRE81/CBF 调控的下游基因
• 1.3.3 DRE81/CBF 基因表达的上游调控
• 1.3.4 DRE81/CBF 基因表达的自身调控
• 1.3.5 ICE1-CBF 信号通路的负调控
• 1.3.6 ICE1-CBF 信号通路的转录后调控
• 1.3.7 DREB 转录因子的DNA 结合活性分析
• 1.3.8 DREB 转录激活机制的研究
• 1.3.9 其它植物系统中的DREB 转录调控
• 1.4 DREB 提高植物抗逆性的研究
• 1.5 烟草研究概述
• 2 引言
• 2.1 研究的目的和意义
• 2.2 研究的内容及思路
• 2.2.1 烟草NtDREB 基因的克隆和表达模式分析
• 2.2.2 酵母单杂交和凝胶滞留分析NtDREB 基因的功能
• 2.2.3 DRE81A 类转录调控区起转录激活作用的关键氨基酸确定
• 2.2.4 ERF/AP2 结构域中与DRE 元件结合的关键氨基酸鉴定
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料和仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 植物材料
• 3.1.1.2 菌株和载体
• 3.1.1.3 试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 植物材料的处理
• 3.2.2 CTAB 法提取烟草基因组DNA
• 3.2.2.1 试剂配制
• 3.2.2.2 基因组DNA 的粗提
• 3.2.2.3 基因组DNA 的纯化
• 3.2.3 Trizol 法提取烟草总RNA
• 3.2.3.1 试剂和耗材
• 3.2.3.2 提取RNA 的实验步骤
• 3.2.4 RT-PCR
• 3.2.5 Genome Walking
• 3.2.6 基因克隆中所用的引物
• 3.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.8 酵母单杂交实验
• 3.2.8.1 酵母细胞的转化
• 3.2.8.2 Colony-lift Filter Assay
• 3.2.9 PDI 融合蛋白表达载体的构建
• 3.2.10 蛋白的诱导表达检测
• 3.2.11 His-Tag 融合蛋白的表达纯化
• 3.2.12 凝胶滞留（EMSA）分析
• 3.2.13 转录调控区激活关键氨基酸的突变
• 3.2.14 ERF/AP2 区与DRE 元件结合关键氨基酸的突变
• 4 结果与分析
• 4.1 烟草NTDREB 基因的克隆
• 4.1.1 从EST 库中BLAST 得到烟草EST 序列
• 4.1.2 NtDREB 基因ERF/AP2 结构域的克隆
• 4.1.3 5’-Genome Walking 扩增基因5’端序列
• 4.1.4 3’-Genome Walking 克隆基因3’端序列
• 4.1.5 NtDREB 基因编码区克隆
• 4.2 NTDREB 基因的序列特征分析和同源比对
• 4.2.1 NtDREB 基因的核酸和蛋白质序列分析
• 4.2.2 NtDREB 基因的序列比对和系统发生分析
• 4.3 NTDREB 基因的表达模式分析
• 4.4 NTDREB 的功能分析
• 4.4.1 NtDREB 的转录激活鉴定
• 4.4.2 DRE81A 类转录因子的转录调控区关键氨基酸的寻找
• 4.4.3 转录调控区定点突变分析
• 4.4.4 NTDREB 与DRE 顺式作用元件结合的功能分析
• 4.4.5 NTDREB-PDI 融合蛋白表达载体的构建
• 4.4.6 NTDREB-PDI 融合蛋白的诱导表达
• 4.4.7 NTDREB-PDI 融合蛋白的提取纯化
• 4.4.8 凝胶滞留分析NTDREB 与顺式作用元件的结合能力
• 4.4.9 ERF/AP2 结构域中与DRE 元件结合的关键氨基酸鉴定
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 NtDREB 基因功能分析
• 5.2.2 DRE81A 类转录调控区起转录激活作用的关键氨基酸分析
• 5.2.3 ERF/AP2 结构域中与DRE 元件结合的关键氨基酸分析
• 参考文献
• ABSTRACT