雌激素受体介导的报告基因试验方法的建立

论文摘要

雌激素受体报告基因试验也称雌激素受体转录激活试验,是EPA推荐的用于环境雌激素筛选的in vitro方法之一。雌激素受体报告基因试验是以受体介导理论为基础,应用基因重组技术,将报告基因置于外源性激素反应元件（ERE）的调控之下,构建重组报告基因载体,应用基因转染技术导入真核细胞内,通过检测化学物作用下报告基因编码的酶活性或蛋白表达的变化,间接反映内源性基因的表达情况。这种方法既可检测化学物与受体的结合能力,又可检测结合后引起的生物学效应,而且能够区分激动剂和拮抗剂,与受体结合试验相比可提供更多的信息,因此成为环境雌激素筛选的有力工具。本研究构建了两种不同ERα介导的报告基因试验,并探讨了它们对三种拟除虫菊酯类农药的雌激素活性的影响。第一部分雌激素受体介导的报告基因试验方法的建立目的建立人ERα和大鼠ERα介导的报告基因试验体系,并比较这两种方法的反应性和灵敏度。方法1.将表达人ERα配体结合域和Gal4-BD（酵母转录因子结合域）融合蛋白的质粒pGal4-ERαdef与Gal4反应的报告基因质粒pUAS-tk-luc、对照质粒phRL-tk分别转染CV-1细胞,转染方式为瞬时转染,建立ER介导的报告基因试验。以E2为阳性对照检测方法的筛选效率。2.将表达大鼠ERα的质粒rERα/pCI与重组Luc报告基因质粒pERE-aug-Luc、对照质粒phRL-tk共转染CV-1细胞,转染方式为瞬时转染,建立rERα介导的报告基因试验。以雌二醇（E2）为阳性对照检测方法的筛选效率。结果1.在两种ERα体系中,E2能明显的诱导Luc的表达,并呈显著的剂量-反应关系,10-7M达到最大值,最大诱导倍数分别为19.6和21.6倍,EC50为2.4 nM和0.9 nM。2.用浓度从10-10M到10-8M的DES染毒hERα体系时,Luc的表达量与E2相似,且10μM的ICI182,780能完全阻断这一效果。结论1.本研究建立的两种ERα报告基因试验具有较高的灵敏度和重复性。E2对Luc的诱导是ER依赖性的,并呈剂量-效应关系。表明该实验系统能够用来检测拟雌激素活性的物质。2.在hERα体系中,ICI182,780能有效抑制E2诱导的Luc的表达,表明hERα体系可以用来检测化学物的抗雌激素活性。3.两种ERα对报告基因试验E2的反应性无明显区别,两种体系的灵敏度也相似。第二部分雌激素受体介导的报告基因试验方法的应用目的应用两种雌激素受体介导的报告基因试验体系检测三种拟除虫菊酯类农药的拟或（抗）雌激素活性,并比较它们对这几种化学物的反应性和灵敏度。方法1.CV-1细胞转染pUAS-tk-luc、pGal4-ERαdef和phRL-tk质粒后用三种拟除虫菊酯类农药（氰戊菊酯,氯氰菊酯,苄氯菊酯）染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的ER激动作用。根据该物质能否拮抗E2诱导的Luc表达,判断化学物的ER拮抗作用。2.CV-1细胞转染rERα/pCI、pERE-aug-Luc和phRL-tk质粒后用三种拟除虫菊酯类农药染毒,根据该物质能否诱导Luc的表达,判断化学物的ER激动作用。结果1.三种拟除虫菊酯类农药在两种体系中可以诱导Luc的表达,并呈显著的剂量-反应关系,在10-4M达到最大值。2.三种拟除虫菊酯类农药均无法抑制10-9M E2所诱导的Luc表达。结论1.所研究的三种拟除虫菊酯类农药都具有一定的拟雌激素活性,但活性强度均远远低于E2。2.三种拟除虫菊酯类农药均无抗雌激素活性。3.两种体系对化学物的反应性和灵敏度基本相同,即两种ERα对报告基因试验筛选雌激素活性物质无明显区别。

论文目录

• 主要缩略词英中文对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 雌激素受体介导的报告基因试验方法的建立
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 雌激素受体介导的报告基因试验方法的应用
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 主要创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 综述
• 环境雌激素的筛选方法及其研究进展