论文摘要
端粒酶逆转录酶hTERT是端粒酶复合物的核心成分之一。hTERT基因异常表达是人类细胞癌变的一个关键步骤,是造成肿瘤细胞端粒酶重新活化、端粒长度稳定性和永生化的原因。近年的研究揭示,细胞癌变不仅造成hTERT基因的异常表达,而且也使这一蛋白在细胞中的分布定位行为发生了改变。在正常原代细胞中表达的hTERT主要是聚集在细胞核的核仁结构中,但在发生转化或肿瘤细胞中,hTERT则主要弥散分布在细胞核的核仁外区域,而染色体DNA发生损伤则能诱导肿瘤细胞中核仁外分布的hTERT聚集到核仁中。这些现象提示调控hTERT核仁定位的过程对细胞癌变及肿瘤细胞的生存有影响。但目前关于调控hTERT核仁定位的结构基础、分子机制及相应的生物学意义并不清楚。在我们实验室前期的研究中鉴定出hTERT的965-981位氨基酸是介导其核仁定位的一个必需的核仁定位信号（C-NTS）,这一核仁定位信号与以往在hTERT的N端发现的核仁定位信号不同,它的突变将导致hTERT完全丧失核仁定位能力。在此基础上,本论文进一步探讨调控hTERT核仁定位的分子机制及其生物学意义的研究。在调控hTERT核仁定位的细胞生物学意义上目前存在的主要争论是这一过程本身是否与细胞内端粒酶复合物组装成熟和端粒酶发挥端粒DNA复制功能所必需的一个步骤。为阐明这一问题,我们将野生型的hTERT及丧失核仁定位能力的hTERT突变体hTERT-3A转入到正常的人成纤维细胞BJ细胞及端粒酶阴性的肿瘤细胞U2os细胞中,发现与野生型hTERT一样,完全丧失了核仁定位能力的hTERT-3A的表达同样能激活正常细胞及端粒酶阴性的肿瘤细胞的端粒酶活性。我们的实验结果首次证明了hTERT蛋白的核仁定位运输无论在正常细胞还是在肿瘤细胞都不是体内端粒酶复合物组装的必需环节,提示端粒酶的组装过程可以发生在核仁外的其它区域。随后我们又利用稳定表达hTERT及hTERT-3A的BJ细胞来研究hTERT核仁定位调控对端粒酶稳定端粒长度及促细胞永生化能力的影响。结果发现hTERT核仁定位行为的丧失并不影响端粒酶发挥其稳定端粒长度和促细胞永生化的功能。以上结果表明hTERT核仁定位行为的调节与细胞端粒酶活性调控、端粒酶稳定端粒DNA以及端粒酶的细胞永生化生物学效应无关。由于DNA损伤能够诱导肿瘤细胞中的核仁外分布的hTERT重新聚集到核仁,提示了调控肿瘤细胞hTERT的核仁定位与肿瘤细胞的DNA损伤反应有密切关系。但这种行为的调控机制和生物学意义目前还是未知的。首先我们对DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集的调控机制进行了初步的研究。通过研究我们发现诱导hTERT核仁聚集是肿瘤细胞特异针对染色体双链DNA损伤的一种细胞学反应,而且这种DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集在肿瘤细胞中具有普遍性。将目前发现的各种hTERT核仁定位结构域的突变体经DNA损伤药物处理然后比较它们的核仁聚集情况发现,对DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集起决定性作用的结构域位于我们发现的hTERT的C-NTS。我们进一步揭示出双链DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集依赖于ATM,而与p53无关。通过对hTERT蛋白结构与功能的进一步研究,我们鉴定出了hTERT C端aa932-953氨基酸序列是DNA损伤诱导其核仁定位的一个反应性调控元件。这一反应性元件位于我们先前鉴定出的hTERT C端核仁定位信号上游附近,并富含多个潜在磷酸化氨基酸残基。缺失aa932-953氨基酸序列或对其中三个潜在磷酸化位点的点突变都能造成hTERT完全丧失对DNA损伤诱导其核仁定位的反应。这一反应性调控元件的鉴定为我们进一步揭示出肿瘤细胞DNA损伤反应中调控hTERT核仁定位的信号途径及分子机制提供了有力条件。在对DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集的调控机制进行初步研究的同时,我们又展开了对hTERT核仁聚集在肿瘤细胞DNA损伤反应中的细胞生物学意义的研究。证明肿瘤细胞DNA损伤反应过程中,hTERT的诱导性核仁聚集与其蛋白稳定性及端粒酶催化活性的调控无关。而最有意义的发现是,hTERT核仁聚集对细胞DNA损伤反应机制存在一种主动性的调控作用。通过对稳定转染野生型hTERT和hTERT-3A突变体的肿瘤细胞在DNA损伤刺激中胞内ATM、H2AX及53BP1DNA损伤分子的磷酸化灶性（foci）活化情况的检测,我们发现与稳定表达丧失DNA损伤诱导核仁定位反应能力的hTERT-3A突变体的细胞相比,稳定表达野生型hTERT细胞在DNA损伤反应中胞内ATM、H2AX及53BP1的磷酸化灶性（foci）的数目及强度显著降低。与此现象相对应的是,我们证明了稳定高表达野生型hTERT能显著提高肿瘤细胞DNA损伤反应中的短期和长期的生存能力,而突变体hTERT-3A则丧失抗DNA损伤诱导凋亡的细胞生物学效应。因此我们首次揭示出了hTERT核仁聚集具有抑制肿瘤细胞的DNA损伤反应的生物学效应,并与促进肿瘤细胞在这种应激反应中的生存有关。端粒稳定性在肿瘤发生发展中的重要作用也使端粒功能的靶向性抑制成为目前抗肿瘤治疗的一个新策略。大量研究已经证明各种因素造成端粒功能障碍也是通过诱导DNA损伤反应途径来抑制肿瘤生长。我们因此通过靶向性抑制各种已知的端粒结构蛋白表达,研究在这些不同实验条件造成的端粒损伤反应中hTERT的诱导性核仁定位情况,结果发现了只有在抑制端粒双链结合蛋白TRF2表达造成的端粒损伤才具有诱导hTERT核仁定位的反应。有意义的是,我们同样证明了在这种端粒损伤中hTERT的核仁聚集也具有抑制细胞DNA损伤反应系统活化的生物学效应。最后我们还发现抑制肿瘤细胞中内源性hTERT表达能够造成肿瘤细胞DNA损伤反应系统的活化,为hTERT本身具有一种内在性的抑制细胞DNA损伤反应的新生物学效应提供了一个有力证据。我们的研究首次证明了端粒酶合成的场所并非在核仁,hTERT的核仁定位行为与端粒酶维持端粒长度并促细胞永生化的功能无关。并对DNA损伤诱导的hTERT核仁聚集的调控机制及其生物学意义进行了初步研究,取得了比较有意义的进展。这对深入了解细胞癌变的基础研究和肿瘤治疗的应用研究具有重要的理论和现实意义。
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