大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为具有低免疫原性的类肝细胞及其特性的实验研究

论文摘要

目的1.探讨骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs）体外诱导分化为类肝细胞（Heatocyte-like cells, HLCs）的可行性及方法。2.BM MSCs及HLCs分别与刀豆蛋白A （concanavalin A, ConA）刺激后的脾淋巴细胞（Lymphocyte, LYM）共培养,观察LYM增殖及转化生长因子β1（Transforming Growth Factor β1, TGF-β1）及白细胞介素6（Interleukin-6, IL-6）的表达情况。3.建立大鼠80%肝切除模型,通过门静脉BM MSCs移植,研究BM MSCs对大鼠自体80%肝切除残肝肝再生及修复作用的实验研究。方法1.采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离、纯化、鉴定BM MSCs,运用改良体外肝分化培养体系诱导BM MSCs向HLCs分化。诱导后4周,观察细胞形态的变化；采用EILSA法检测诱导分化后HLCs上清液中白蛋白（Albumin, ALB）及尿素的分泌；RT-PCR检测肝细胞标志性基因甲胎蛋白（Alpha-Fetal Protein, AFP）、ALB和细胞角蛋白18（Cytokeratin18, CK18） mRNA的表达。2.采用梯度密度离心法提取Lewis大鼠脾LYM,取分离纯化的第3代Wistar大鼠来源的BMMSCs及HLCs分别与ConA刺激后的Lewis大鼠来源的脾LYM共培养36h及72h。收集共培养后细胞培养液上清,MTT法检测LYM增殖情况；ELISA法检测BM MSCs和HLCs与脾LYM共培养后上清液中TGF-β1和IL-6的水平；流式细胞仪检测各组LYM S期细胞所占细胞周期的百分比。3.建立大鼠80%肝切除模型：取6-8周龄,体重200～220g的Wistar大鼠,分为实验组16只（术后立即经门静脉注射BM MSCs）和对照组20只（注射等量生理盐水）,采用生物化学方法检测肝功能,流式细胞仪和免疫组化检测肝细胞周期和增殖细胞核抗原（Proliferation Cell Nuclear Antigens, PCNA）。结果1.体外成功分离培养、扩增、纯化BM MSCs.2. BM MSCs体外诱导分化为HLCs及特性的研究：在向HLCs诱导分化培养体系的培养下,BMMSCs细胞形态由长梭形逐渐转化成为多角形或类圆形,并且表达AFP、CK-18、 ALB mRNA,诱导组HLCs培养上清液中检测到ALB及尿素的分泌。HLCs+LYM+ConA组与LYM+ConA组相比,TGF-β1表达水平明显升高,差异具有显著的统计学意义（P<0.01）；IL-6表达的水平显著降低,差异具有显著的统计学意义（P<0.01）。MTT法检测共培养后LYM OD值：HLCs+淋巴细胞+ConA组OD值明显小于LYM+CorA组,差异具有显著的统计学意义（P<0.01）。HLCs+LYM+CojA组与BM MSCs+LYM+ConA组相比,TGF-β1及IL-6水平差异均无显著的统计学意义,两组OD值差异亦无显著的统计学意义。流式细胞仪检测提示：LYM+ConA组S期细胞比例为31.20%±2.36%,BM MSCs+LYM+ConA组S期细胞比例为3.45%±1.87%,HLCs+LYM+ConA组S期细胞比率为6.27%±0.62%, HLCs+LYM+ConA组与LYM+ConA组相比,差异具有显著的统计学意义（P<0.01）。3.BM MSCs对自体80%肝切除残肝再生及修复的研究：术后生存率：实验组术后生存率为93.7%,对照组为75%；实验组肝组织HE染色显示：肝细胞坏死及炎性细胞增生、细胞水肿、气球样变与对照组相比明显减轻；实验组术后1d、3d、7d,肝功能丙氨酸氨基转移酶（AlanineAminotransferase, ALT）%口门冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase,AST）水平降低明显优于对照组,差异有显著的统计学意义（P<0.05）；实验组肝细胞周期中S期细胞比例与对照组相比明显增高（P<0.05）；残肝免疫组化：实验组PCNA表达水平明显高于对照组（P<0.05）。结论1.BM MSCs具有向HLCs分化的潜能。2.HLCs与BM MSCs同样具有促进TGF-β1分泌并抑制IL-6分泌的作用,都具有抑制ConA刺激后的异种属LYM增殖的作用,证实BM MSCs和分化后的HLCs具有低免疫原性。3.经门静脉注射BM MSCs可以促进大鼠80%肝切除后残余肝脏细胞的再生及修复,可以显著提高80%肝切除后大鼠生存率,证实BM MSCs具有促进肝细胞增殖和修复的作用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法及意义
• 一、体外BM MSCs分化为HLCs及其特性的实验研究
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验方法
• 1.1.3 统计学方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 BM MSCs形态学观察及表型鉴
• 1.2.2 BM MSCs向HLCs诱导分化及细胞鉴定
• 1.2.3 BM MSCs与ConA刺激后的LYM共培
• 1.2.4 HLCs与ConA刺激后的LYM共培
• 1.3 讨论
• 二、BM MSCs促进大鼠80%肝切除残肝再生及修复的作用
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 统计学方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 BM MSCs形态学观察及表型
• 2.2.2 生存率比较
• 2.2.3 细胞活体示踪
• 2.2.4 残肝组织HE染色
• 2.2.5 残肝组织透射电镜检测
• 2.2.6 BM MSCs对肝功能的影
• 2.2.7 BM MSCs对残肝细胞周期的影
• 2.2.8 BM MSCs对细胞周增殖的影响
• 2.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 综述
• 综述参考文献
• 致谢