论文摘要
心肌肥厚是心脏对多种疾病包括高血压、机械负荷、心肌梗塞、心律失常、内分泌机能紊乱的适应性反应,是心脏输出做功增加的最初代偿性机制反应。持续性的心肌肥大能够引起扩张性心肌病,心衰甚至猝死。心肌肥厚是心血管疾病的独立危险因素。影响心肌肥厚的因素主要包括:一为机械性因素,包括压力负荷与容量负荷;二为神经性与体液性因素,包括肾素–血管紧张素系统–醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS）、交感神经系统、肾上腺髓质激素、甲状腺素、内皮素（ET）、心肌肥厚肽、醛固酮（ALD）、心房钠尿肽（ANP）、一氧化氮（NO）等。研究表明,RAAS对维持心血管系统功能稳定非常重要,并且在心肌肥厚发生中起重要作用。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）具有正性变力作用和强烈的血管收缩作用,能刺激细胞蛋白质合成,参与了心肌肥厚的早期信号传导。心肌肥厚包括心肌细胞体积的肥大和心肌间质细胞增殖两个最基本的过程。因此,开发一种有效的抗心肌肥厚的药物是心血管研究中的重要课题。先前实验研究表明单味蜈蚣有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化等作用,离体实验证实,蜈蚣的成分提取物酸性蛋白（Centipede Acidic Protein,CAP）浓度依赖性的提高窦房结频率,增强心肌收缩力等广泛的心血管作用。本实验通过细胞免疫化学、流式细胞术、激光共聚焦、分子生物学（Western blot,RT-PCR）等技术在整体水平研究CAP对压力超负荷性心肌肥厚模型及急性心力衰竭大鼠的作用;从细胞与分子水平研究CAP对培养的乳鼠心肌细胞凋亡及心肌成纤维细胞增殖的作用及其机制:（1）CAP对压力超负荷性心肌肥厚的作用及机制研究;（2）CAP对AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的影响;（3）CAP对AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖的影响及其机制研究;（4）CAP对急性心力衰竭大鼠心功能的影响。第一部分蜈蚣酸性蛋白对压力超负荷性心肌肥厚的作用及机制研究目的:研究CAP对压力超负荷性心肌肥厚（pressure-overload induced cardiac hypertrophy,POH）模型大鼠的作用及机理。方法:大鼠随机分为4组:假手术组（saline,1ml·100g-1,i.p.）、模型对照组（saline,1ml·100g-1,i.p.）、卡托普利组（captopril,30mg·kg-1,i.g.）、CAP干预组（CAP,2.0g·kg-1,i.p.）。采用大鼠腹主动脉缩窄术复制POH模型。于术后第8周测定心功能及血液指标,包括心率（HR）、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均动脉压（MBP）、左室收缩峰压（LVSP）、左室舒张末压（LVEDP）、室内压最大上升速率（+dp/dtmax）、室内压最大下降速率（-dp/dtmax）、左室质量指数（LVMI）、AngⅡ、ET、ALD、ANP、NO、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）。取部分左室游离壁中段心肌组织,经全自动图象分析系统行图象分析:HE染色观察心肌病理改变并测量各组心肌细胞直径（MD）;Masson染色观察心肌胶原变化并计算心肌胶原容积分数（CVF）。结果:1、POH组HR为384.0±21.5,SBP、DBP、MBP分别为28.12±1.75、18.24±1.18、24.78±1.27,与假手术对照组相比均有显著性差异（P<0.01）;给药后,CAP 2.0g·kg-1组HR为353.8±22.8,SBP、MBP分别为25.84±1.54、22.16±1.95,与POH组相比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。2、POH组LVSP、LVEDP分别为24.52±1.89、2.86±0.84,+dp/dtmax、-dp/dtmax分别为1032.6±116.2、874.2±51.3,与假手术对照组相比均有显著性差异（P<0.01）;给药后,CAP 2.0g·kg-1组LVEDP为1.98±0.57,+dp/dtmax、-dp/dtmax分别为1213.0±119.1、978.6±65.0,与POH组相比有显著性差异（P<0.05）。3、POH组LVMI、MD、CVF分别为3.11±0.14、44.80±4.03、21.86±0.62,与假手术对照组相比均有显著性差异（P<0.01）;给药后,CAP 2.0g·kg-1组LVMI、MD、CVF分别为2.51±0.22、34.20±2.17、20.48±0.60,与POH组相比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）。4、POH组AngⅡ、ALD、ET、ANP分别为122.93±17.42、156.34±30.42、150.44±13.24、563.38±77.20,与假手术对照组相比均有显著性差异（P<0.05或P<0.01）;给药后,CAP 2.0g·kg-1组AngⅡ、ALD、ET、ANP分别为102.95±20.56、127.90±26.66、130.82±8.41、491.97±56.74,与POH组相比有显著性差异（P<0.05）。5、POH组NOS、NO、SOD分别为16.13±2.27、134.71±38.48、40.55±5.95,与假手术对照组相比均有显著性差异（P<0.01）;给药后,CAP 2.0g·kg-1组NOS、NO、SOD分别为19.32±1.66、175.22±45.83、47.66±5.51,与POH组相比有显著性差异（P<0.05）。结论:CAP可抑制心肌细胞肥大和胶原沉积,阻止心室肥厚的发生,进而改善心功能、延缓心肌肥厚的发生发展。其作用机制可能是通过RAAS、NO系统及阻止氧自由基对细胞膜的攻击而发挥的。第二部分蜈蚣酸性蛋白对AngⅡ诱导心肌细胞凋亡的影响目的:研究CAP对AngⅡ诱导培养心肌细胞凋亡的影响及机制。方法:在培养的原代乳鼠心肌细胞的基础上,随机分组:空白对照组（无血清培养液）;AngⅡ模型组（10-7mol·L-1）;CAP高剂量组（ AngⅡ10-7mol·L-1+CAP 4.8mg·L-1 ） ; CAP低剂量组（AngⅡ10-7mol·L-1+CAP 0.48mg·L-1）。通过噻唑蓝（MTT）法观察CAP对培养心肌细胞活力的影响;采用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况;使用半胱胺酸-天门冬胺酸酶（caspase-3）活性检测试剂盒,分光光度法检测心肌细胞凋亡过程中caspase-3活性的变化;细胞免疫化学测定Bcl-2、Bax的表达;采用半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法测定相关基因c-fos mRNA表达;免疫印迹法（Western blot）测定心肌细胞钙调神经磷酸酶（CaN）蛋白的表达。结果:1、AngⅡ能明显降低心肌细胞活力,MTT值为0.2648±0.0420,与空白组相比有显著性差异（P<0.05）,不同浓度的CAP （4.8mg·L-1、0.48mg·L-1 ）能明显增加心肌细胞活力,MTT值分别为0.3002±0.0704、0.2806±0.0610,明显高于AngⅡ组（P<0.05）。2、AngⅡ组caspase-3活性显著增加为2.8±0.7,与空白组相比有显著性差异（P<0.05）,不同浓度的CAP（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1）caspase-3活性分别为1.2±0.4、1.8±0.5,明显低于AngⅡ组（P<0.05）。3、AngⅡ组Bax蛋白表达显著增加为13.64±4.32,与空白组相比有显著性差异（P<0.01）,不同浓度的CAP（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1 ）Bax蛋白表达分别为5.85±2.04、10.89±3.95,明显低于AngⅡ组（P<0.05或P<0.01）。AngⅡ组Bcl-2蛋白表达显著降低为11.95±3.98,与空白组相比有显著性差异（P<0.01）,不同浓度的CAP（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1）组Bax蛋白表达分别为22.26±6.53、17.34±4.05,明显高于AngⅡ组（P<0.05或P<0.01）。4、AngⅡ组c-fos mRNA表达为0.82±0.05,与空白组相比有显著性差异（P<0.05）,不同浓度的CAP（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1）组c-fos mRNA表达分别为0.51±0.11、0.66±0.07,明显低于AngⅡ组（P<0.05）。5、AngⅡ组CaN蛋白表达为19.38±4.72,与空白组相比有显著性差异（P<0.01）,不同浓度的CAP（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1）组CaN蛋白表达分别为11.28±2.68、14.82±3.67,明显低于AngⅡ组（P<0.05或P<0.01）。结论:CAP对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用,其机制与降低caspase-3活性、提高Bcl-2表达、降低Bax、c-fos mRNA及CaN蛋白表达有关。第三部分蜈蚣酸性蛋白对AngⅡ诱导心肌成纤维细胞增殖的影响及其机制研究目的:研究CAP对AngⅡ诱导培养心肌成纤维细胞（cardiac fibroblasts, CFb）增殖和胶原合成的影响,探讨其抑制心肌纤维化的机制。方法:用消化法分离并培养新生SD大鼠的CFb,随机分组:空白对照组（无血清培养液）;AngⅡ模型组（10-7mol·L-1）;CAP高剂量组（ AngⅡ10-7mol·L-1+CAP 4.8mg·L-1 ） ; CAP低剂量组（AngⅡ10-7mol·L-1+CAP 0.48mg·L-1）。MTT法检测CAP对CFb增殖的影响;羟脯氨酸测定CFb胶原合成量;硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO含量;RT-PCR法测定相关基因c-myc mRNA表达;流式细胞仪测定细胞周期。结果:1、AngⅡ能够明显增加心肌成纤维细胞的增殖（0.6702±0.1104,P<0.01,vs control group）,4.8mg·L-1、0.48mg·L-1 CAP作用于心肌成纤维细胞均能够明显抑制AngⅡ诱导的成纤维细胞的增殖（0.4306±0.1610, 0.3118±0.0853）,（P<0.05, vs AngⅡgroup）;2、AngⅡ能够增加胶原的合成（0.85±0.06）,（P<0.01 vs control group）,4.8mg·L-1、0.48mg·L-1CAP均能够明显抑制AngⅡ诱导的胶原合成的增加（0.72±0.13,0.55±0.08）,（P<0.05, vs AngⅡgroup）。3、AngⅡ组的G0/G1、S、G2/M期细胞百分率分别是（65.0±6.7）%、（19.3±2.5）%、（15.7±4.5）%,与空白组比较分别降低G0/G1期,升高S期细胞百分率（P<0.05或P<0.01）。不同浓度的CAP（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1）组G0/G1期细胞百分率分别为（76.8±4.4）%、（75.2±6.0）%,均明显高于AngⅡ组（P<0.01）;而S期细胞百分率分别为（14.6±1.4）%,（14.4±1.4）%,明显低于AngⅡ组（P<0.05）,G2/M期细胞百分率分别为（8.6±4.4）%、（10.4±4.5）%,亦明显低于AngⅡ组（P<0.05或P<0.01）;AngⅡ组的增殖指数（PI）为（35.0±6.7）%,明显高于对照组（P<0.01）,不同浓度的CAP组（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1）PI分别为（23.2±4.4）%、（24.9±6.0）%,明显低于AngⅡ组（P<0.01）。4、AngⅡ组NO含量为15.35±3.06,与空白组相比有显著性差异（P<0.01）,不同浓度的CAP（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1）组NO含量分别为24.44±3.23、20.92±2.36,明显高于AngⅡ组（P<0.05）。5、AngⅡ组c-myc mRNA表达为0.79±0.06,与空白组相比有显著性差异（P<0.05）,不同浓度的CAP（4.8mg·L-1、0.48mg·L-1）组c-myc mRNA表达分别为0.48±0.13、0.63±0.08,明显低于AngⅡ组（P<0.05）。结论:CAP通过抑制AngⅡ诱导的CFb的增殖和胶原合成的增加,从而发挥有效的抗心肌纤维化的作用,其机制可能与提高NO含量及下调c-myc mRNA表达有关。第四部分蜈蚣酸性蛋白对急性心力衰竭大鼠心功能的影响目的:研究CAP对多柔比星（Doxorubicin Hydrochloride, DH）致急性心力衰竭大鼠的作用及机理。方法:大鼠随机分为4组:空白对照组、DH组、CAP高、低剂量组。空白对照组及DH组每天腹腔注射生理盐水1ml·100g-1,CAP高、低剂量组分别腹腔注射2.0g·kg-1、1.0g·kg-1,连续3天。第4天除空白对照组外其余各组一次性腹腔注射DH 10mg·kg-1,复制大鼠急性心衰模型。第5天测定心功能、血清生化,并观察心肌病理学变化。结果:1、DH组LVSP、LVEDP分别为92.4±15.7、36.8±12.9,+dp/dtmax、-dp/dtmax分别为4355.2±860.6、3097.6±162.1,与空白对照组相比均有显著性差异（P<0.05）;CAP 2.0g·kg-1组LVSP、LVEDP分别为122.2±8.9、23.3±9.8,+dp/dtmax、-dp/dtmax分别为8930.8±1928、4463.6±968.5,与DH组相比有显著性差异（P<0.05）。2、DH组NOS、NO、MDA、SOD分别为23.90±0.51、190.05±18.30、8.53±1.01、62.05±4.97,与空白对照组相比均有显著性差异（P<0.05）;CAP 2.0g·kg-1组NOS、NO、MDA、SOD分别为22.16±0.44、53.90±19.59、5.76±0.73、89.38±4.07,与DH组相比有显著性差异（P<0.05）。3、DH组部分心肌细胞水肿明显,可见脂肪变性、核固缩、出血;CAP 2.0g·kg-1组心肌细胞形态基本正常,排列整齐,胞核呈椭圆形深染,胞浆纹理清晰,无明显变性坏死。结论:CAP可明显改善急性心衰大鼠心功能,对心肌具有一定的保护作用。其机制可能与调节大鼠体内自由基代谢及增强心脏泵血功能有关。结论1、CAP可抑制心肌细胞肥大和胶原沉积,阻止心室肥厚的发生,进而改善心功能、延缓心肌肥厚的发生发展。其作用机制可能是通过RAAS、NO系统及阻止氧自由基对细胞膜的损伤而发挥作用的。2、CAP对AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用,其机制可能与降低caspase-3活性、提高Bcl-2表达、降低Bax、c-fos mRNA及CaN蛋白表达有关。3、CAP通过抑制AngⅡ诱导的CFb的增殖和胶原合成的增加,从而发挥有效的抗心肌纤维化的作用,其机制可能与提高NO含量及下调c-myc mRNA表达有关。4、CAP可明显改善急性心衰大鼠心功能,对心肌具有一定的保护作用。其机制可能与调节大鼠体内自由基代谢及增强心脏泵血功能有关。
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