正常人尿液糖蛋白质组学研究及大肠杆菌DH5α分泌蛋白质组研究

论文摘要

作为成熟蛋白分泌或定位于细胞膜上的必要结构，N型糖基化修饰在很多生物学过程中发挥了重要的作用。糖蛋白量和／或糖基化状态的改变应该都可以在亲和富集的糖蛋白表达谱中有所体现。本实验以正常成人尿液为研究对象，对其中经由凝集素刀豆蛋白A富集的N型糖蛋白进行鉴定和分析。正常男性及女性混合尿液经丙酮沉淀提取尿蛋白，应用刀豆蛋白A亲和层析富集N型糖蛋白，使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳或液相色谱分离后进行串联质谱鉴定和数据分析。串联质谱鉴定结果应用AMASS软件进行质量控制筛选，同时应用反向数据库搜索法评价假阳性率。最终共得到225个视为阳性鉴定结果的蛋白，其中每个肽段的可信度都在97％以上。在这些蛋白中，有94个在以前的尿蛋白质组研究中有过鉴定。150个蛋白在SWISS-PROT中已证实为糖蛋白或糖蛋白亚基，43个蛋白经软件NetNGlyc 1.0 Server预测有是糖蛋白的可能。应用糖苷酶酶切和特征性的天冬酰胺序列子的检测发现了39个蛋白中的48个潜在的N型糖基化位点。为了丰富尿刀豆蛋白A捕获蛋白谱的信息，119个仅由一个合格二级谱图鉴定的蛋白质也列了出来。与尿全蛋白质组相比，尿糖蛋白质组可以去掉一些高丰度的蛋白因此可以更加完整地刻画尿蛋白质组。同时，在很多肾脏疾病中常常伴随蛋白尿的发生，而糖蛋白的富集可以有效地去除非N—糖蛋白白蛋白，因此对于健康状态的描述，尿糖蛋白质组可能是比全蛋白质组更好的选择。细菌分泌蛋白对于细菌自身在环境中生存起着很多至关重要的作用，随着蛋白质组学概念的逐步完善和技术的不断成熟，在一次实验中大规模的鉴定细菌分泌蛋白质已经成为可能。本实验应用一维液相色谱—串联质谱鉴定方法对大肠杆菌DH5α在M9培养基中的分泌蛋白质组进行了分析，最终得到包括各种酶类、结合和转运蛋白等阳性鉴定蛋白质53个，主要参与对抗外界恶劣环境，营养物质的摄取和转运及代谢，蛋白质、糖类、脂类合成与代谢等重要生物学过程。同时对于蛋白进入培养基的原因进行了探讨。本文对大肠杆菌分泌蛋白组的初步研究为蛋白质组学在节兰氏阴性菌分泌蛋白研究上的应用作了有益的尝试，为今后在重组蛋白分泌及致病性大肠杆菌感染疾病的研究奠定了一定的基础。

论文目录

• 序言
• 第一部分 正常人尿液N型糖蛋白质组分析
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 主要仪器设备及试剂
• 实验方法
• 实验流程图
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附表1
• 附表2
• 附表3
• 第二部分 大肠杆菌DH5α分泌蛋白质组研究
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 材料
• 实验方法
• 实验结果和讨论
• 结论
• 参考文献
• 第三部分 文献综述 糖蛋白质组研究进展
• 糖蛋白分类及研究现状
• 糖蛋白/糖肽的富集
• 糖蛋白/糖肽的鉴定
• 糖蛋白质组在人类蛋白表达谱研究中的应用
• 参考文献
• 简历
• 致谢
• 附录