microRNA-21对猪骨骼肌生长发育调控的研究

论文摘要

在饲养条件一致前提下,猪产肉量的高低和肉品质主要取决于肌纤维的数量和横截面积,而猪的肌纤维数量在胚胎期间就已经固定,所以胚胎间骨骼肌的生长发育成为猪产肉数量和性状的一个重要因素。而骨骼肌的生长发育是个很复杂的生物学过程,受到多种因素的调控,研究表明microRNA （miRNA）对其发挥重要调控作用。microRNA是一类具有调控功能的内源性非编码的小分子,其长约18～25个核苷酸,主要参与基因转录后水平的调控,对生物体的生长、发育、衰老和死亡等生物学过程都有着重要的作用。本课题组通过高通量测序,发现miR-21在猪胚胎骨骼肌发育过程中有差异表达,且在特定阶段存在丰富表达。鉴于miR-21在医学疾病中的重要作用意义和本课题的新发现,我们开展,miR-21对猪骨骼肌发育调控的研究,旨在为后期猪骨骼肌发育调控机理和猪的遗传育种相关研究提供参考信息。microRNA通过调控靶基因表达而广泛参与体内众多生理和疾病过程,miR-21调控骨骼肌的发育也是同样的机理。我们运用生物信息学检索比较分析,确定候选靶基因TGFBI,设计引物,合成miR-21minics,克隆获得猪TGFBI基因的部分3’UTR,构建Psi-Check2-TGFBI3’UTR载体,转染PIEC和PK15细胞,检测萤光素酶活性。同时利用荧光定量PCR和Western blot等试验验证rniR-21在RNA和蛋白水平上的变化。结果发现转染miR-21minics组荧光素酶活性低于对照组,miR-21在RNA水平上抑制（?） TGFBI基因的表达,但差异不显著（P>0.05）,同时在蛋白水平也发生了抑制现象,差异显著（P<0.05）。同时利用荧光定量PCR,检测了miR-21及其候选靶基因TGFBI在通城猪和长白猪中的组织表达谱,以及出生前后骨骼肌发育中（28个发育阶段）的表达变化,结果显示rniR-21在通城猪和长白猪中时空表达谱有差异,组织表达分析显示,miR-21在成年通城母猪的卵巢中表达最丰富,远远高于其他组织（P<0.05）。在成年长白母猪中,miR-21在肝脏组织中表达显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织中分布相对平衡,没有发现特异性表达组织；通城猪与长白猪相比较发现,miR-21在通城猪和长白猪同一个组织表达存在差异。在心、肝、肺、肾、小肠、子宫和背最长肌中长白猪miR-21的表达量显著高于通城猪（P<0.05）,其他组织（脾、卵巢）差异不显著。时期表达谱分析发现,IniR-21在脂肪型通城猪和瘦肉型长白猪骨骼肌生长发育过程中表达模式存在明显差异,通城猪从胚胎期33d到成年,miR-21都有不同程度的表达,在胚胎期90d达到峰值。长白猪中,出生前的E33d几乎检测不到表达而胚胎期105d最高表达丰度,其他阶段之间miR-21表达变化不大,成年背最长肌中相对较低。IniR-21的表达在胚胎期55d,80d、90d和95d,通城猪和长白猪存在显著差异。在mRNA水平,候选靶基因TGFBI在成年通城猪和长白猪组织表达谱相对一致,TGFBI在脾脏中含量最丰富,显著高于其他组织（P<0.05）,其次肺中也有较高的表达,成年背最长肌中TGFBI水平最低,心肌中表达也很低。其他组织（肝、小肠、子宫和肾）也检测至（?） TGFBI有较低的表达。通城和长白猪整个发育期的骨骼肌中基本都检测出TGFBI的表达。胚胎期33d至胚胎期50d表达量成上升趋势,胚胎期50d达到峰值,随着骨骼肌的发育,TGFBI含量也逐渐减少,成年骨骼肌中几乎检测不到TGFBI的存在。胚胎期55d、100d和出生后9d、180d和成年猪中,TGFBI表达存在显著差异。分析miR-21与TGFBI在骨骼肌发育表达变化之间的相关性,发现通城猪中存在负相关性,相关系数为-0.421（P=0.026<0.05）,为中度相关。长白猪则没有显著的相关性（相关系数为-0.123,P=0.40>0.05）。由此推断TGFBI可能与猪骨骼肌生长发育及品种间肌肉表型差异有关,在miR-21的作用下,调控骨骼肌的生长发育。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文縮略表
• 第一章 文献综述
• 一、miRNA的形成及生物学功能
• 1.1 miRNA的形成
• 1.2 miRNA的生物学功能
• 二、骨骼肌的遗传控制
• 2.1 肌肉的形成
• 2.2 肌肉的调控
• 三、miRNA对肌肉生长发育的调控
• 3.1 对肌肉特异表达的miRNAs
• 3.2 miRNAs在肌肉中的功能
• 3.3 miRNAs与肌肉疾病
• 四、miRNA靶标的实验验证
• 4.1 生物信息学预测miRNA靶标
• 4.2 ΔG法分析（miRNA的易近性）
• 4.3 miRNA与mRNA相互间的作用
• 4.4 miRNA和靶基因mRNA的共表达
• 4.5 miRNA对靶基因蛋白及其生物功能的影响
• 五、miR-21与TGFBI的研究进展
• 5.1 miR-21基因的研究进展
• 5.2 TGFBI基因的研究进展
• 六、试验的目的和意义
• 参考文献
• 第二章 试验研究
• 一、实验材料
• 1.1 实验动物及样品采集
• 1.2 试剂
• 1.3 主要仪器设备
• 1.4 生物学工具分析软件及网站
• 1.5 实验设计方案
• 二、实验方法
• 2.1 引物的设计
• 2.2 总RNA提取
• 2.3 cDNA的合成
• 2.4 靶标预测
• 2.5 猪TGFBI序列拼接
• 2.6 Psi-Check2-TGFBI mRNA 3'UTR载体构建
• 2.7 细胞的培养
• 2.8 细胞转染
• 2.9 萤光素酶活性检测
• 2.10 Real-time PCR和Western blot
• 2.11 miR-21和TGFBI定量PCR
• 2.12 TGFBI生物学信息分析
• 2.13 统计学处理
• 三、实验结果
• 3.1 RNA质量检测结果
• 3.2 靶标预测结果
• 3.3 猪TGFBI序列拼接
• 3.4 Psi-Check2-TGFBI 3'UTR载体的构建
• 3.5 细胞转染
• 3.6 双萤光素酶活性检测
• 3.7 Real-time PCR和Western blot结果
• 3.8 miR-21和TGFBI时空表达谱
• 3.9 TGFBI蛋白序列生物信息学分析
• 四、讨论
• 4.1 关于靶标验证
• 4.2 关于miR-21研究
• 4.3 关于TGFBI基因的功能
• 4.4 miR-21调控TGFBI
• 五、结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢