论文摘要
研究背景肾纤维化（包括肾小球硬化和间质纤维化）是几乎所有肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同通路,是以肾小管萎缩、间质成纤维细胞增生及细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）过度积聚为特征的病理改变。在肾脏疾病时,肾间质内浸润的炎症细胞特别是单核细胞及活化的肾小管上皮细胞合成分泌的促纤维化因子,如转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、内皮素及血小板衍生生长因子（Platelet derived growth factor,PDGF）等,以旁分泌方式作用于成纤维细胞,使之活化、增殖,不仅数量增加,还会转分化为肌成纤维细胞（MFB）,表达标志性蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle action,a-SMA）,同时分泌大量的ECM,包括Ⅲ型胶原及纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN）等。因此抑制肾成纤维细胞的活化增殖,降低ECM的分泌,在阻止甚至逆转肾间质纤维化过程中起至关重要的作用。肾间质纤维化是由于各种原发或继发性肾脏病持续发展,导致肾脏正常组织结构被细胞外基质所取代,并伴随肾脏功能不可逆损害的病理过程,其特征性的病理改变是肾小管萎缩伴间质成纤维细胞增生及细胞外基质的过度聚集。关于肾小管间质纤维化的机制,目前研究认为可能与以下诸因素有关：①间质成纤维细胞的激活：多数学者认为,间质中的成纤维细胞是肾间质纤维化的主要效应细胞,间质成纤维细胞的激活是肾间质纤维化的中心环节之一。②细胞外基质的过度沉积：ECM在维持肾脏的正常组织结构与功能及细胞的生长,分化过程中起着非常重要的作用,它处于不断的代谢更新和降解重塑的动态平衡中,在肾间质纤维化中,降解细胞外基质的基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMPS）活性降低,而抑制细胞外基质降解的金属蛋白酶组织抑制因子（Tissue inhibitors of metalloproteinase,TIMPs）表达上调,致ECM这种动态平衡失调。ECM在肾间质的过度沉积是引起肾间质纤维化的主要原因[2]。③某些血管活性物质,生长因子,细胞因子的作用：如血管紧张素,转化生长因子-p1（TGF-β1）,成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth faetor,FGF）,血小板源性生长因子（PDGF）,结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）,肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-a,TNF-a）,白介素-1 （Interleukin-1,IL-1）,内皮素-1（ET-1）,骨形态发生蛋白-7 （Bone morphogenetic protein-7,BMP-7）等参与成纤维细胞的激活,细胞增殖,小管上皮细胞表型转化及细胞外基质增多等过程。④细胞凋亡：推测肾小管间质纤维化中,大量肾小管上皮细胞消失可能与细胞凋亡有关。⑤肾小管上皮细胞转分化：正常情况下肾小管上皮细胞表达上皮细胞的标志蛋白-角蛋白,但在病理状态下,肾小管上皮细胞具有向间充质细胞转分化的能力,表达间质细胞的标志蛋白-波形蛋白及α-SMA。近年来,现代医学抗肾纤维化的研究很多,但真正能取得临床应用的却很少,大多尚处于实验阶段。相反,中医药不仅在防治慢性肾功能衰竭临床应用广泛,同时在肾纤维化的实验研究方面也取得了可喜的成绩,为临床打下了坚实的基础。红背叶根别名红灵丹、红罗裙、红帽顶、红背娘、红骨白颧树根,为大戟科山麻杆属植物红背山麻杆Alchorneatrewioides （Benth） Muell.2Arg.的干燥根。味甘、微寒。归小肠、膀胱经。有清热利湿,散瘀止血之效。已有的研究表明红背叶根有拮抗大鼠酒精性、中毒性肝纤维化作用,并对免疫性大鼠肝损害有保护作用。中医理论有“异病同治”之说,而现代的研究表明,肝纤维化与肾间质纤维化的形成机理基本相同,都是各种致病因素导致ECM在脏器的沉积。根据肝、肾间质纤维化的形成机理相似,结合我们目前的研究,红背叶根对肝纤维化有很好的抗纤维化疗效,那么红背叶根对肾纤维化是否同样有良好的抗纤维化作用呢?因此,本实验通过观察红背叶根对肾间质性纤维化大鼠病理组织、血液学指标及TGF-β1表达的影响,初步探讨其抗纤维化机理。目的通过研究红背叶根对单侧输尿管结梗阻（Unilateral ureteral obstruction,UUO）致肾间质纤维化大鼠的肾脏病理组织、肾功能、纤维化四项、血流变及肾组织TGF-β1表达等指标的影响,探讨红背叶根对肾间质纤维化的保护作用及其作用机理。方法1.动物模型的建立分组及处理SPF级SD大鼠40只,雌雄各半,体质量180-200 g,适应性饲养1周后,随机平均分为5组：假手术组、模型组、大黄蟅虫丸对照组、红背叶根低剂量组、红背叶根高剂量组。通过单侧输尿管结扎术建立肾间质纤维化动物模型,其中假手术组仅游离左侧输尿管,不行结扎即缝合皮肤。术中严格遵守无菌操作。大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量组及高剂量组大鼠在造模同时分别按1 ml/100 g灌予相应药物,每天1次；假手术组及模型组大鼠灌予生理盐水。所有动物均予普通饲料,自由饮水,共4周。实验期满,取肾脏组织,行HE及Masson染色,光镜下观察肾脏组织细胞的病理改变及肾间质纤维的增生程度；取动物血清上层,用全自动生化分析仪测定血清尿素氮（Blood urea nitrogen,BUN）、血清肌酐（Serum creatinine,Scr）;用放免法测定血清透明质酸（Hyaluronidase,HA）、层粘连蛋白（Laminin,LN）、Ⅲ型前胶原（TypeⅢProcollagen,PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Collagen TypeⅣ,Ⅳ-C）;用血液流变仪测定不同切变率的全血粘度及红细胞压积；通过免疫组化观察肾脏组织TGF-β1的表达。2.统计学分析实验结果计量资料用均数±标准差表示,多组比较用one-way ANOVA,方差齐性时,采用LSD方法进行组间多重比较,方差不齐时,采用DunnettT3方法进行组间多重比较；等级资料采用Kruskal-Wallis H非参数检验。用统计软件SPSS13.0进行分析,以P<0.05定为差异有统计学意义。结果1.病理结果1.1 HE染色显示：假手术组大鼠肾脏结构正常,肾小管排列紧密、整齐,小管基底膜光滑、连续,小管间质内无炎症细胞浸润。模型组大鼠可见绝大多数肾小球及肾小管坏死,残存的肾小管萎缩或扩张；肾间质严重纤维化,炎症细胞弥漫性浸润。大黄蟅虫丸组大鼠大多数肾小球及肾小管坏死,残存的肾小管萎缩或扩张；肾间质纤维化,炎症细胞浸润。红背叶根低剂量及高剂量组大鼠少数肾小球及肾小管坏死,部分肾小管扩张；大多数肾小球及肾小管正常；肾间质轻度纤维化,炎症细胞浸润。1.2 Masson染色显示：假手术组肾脏胶原染色主要位于肾小球底膜、Bowman囊、系膜区和肾小管间的毛细血管周围,而小管周围间质部分比较狭窄；模型组肾小管扩张,肾间质宽度增加,蓝色的胶原纤维增加,染色加深；大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组肾小管扩张、间质增宽程度及胶原在间质沉积程度较模型组降低。肾间质胶原染色面积百分比：与假手术组比较,模型组、大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组均显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较,大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组均显著下降,差异有统计学意义（P<0.05）；与大黄蟅虫丸组比较,红背叶根低剂量及高剂量组均无显著性差异,差异无统计学意义（P>0.05）。2.血液指标结果2.1红背叶根对大鼠血清BUN、Scr的影响：与假手术组比较,模型组、大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组大鼠血清BUN、Scr均显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较,大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组大鼠血清BUN、Scr均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）；与大黄蟅虫丸组比较,红背叶根低剂量组及高剂量组大鼠血清BUN、Scr均无显著差异,差异无统计学意义（P>0.05）。2.2红背叶根对大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影响：与假手术组比较,模型组、大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ⑧-C均显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较,大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组大鼠血清HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）；与大黄蟅虫丸组比较,红背叶根低剂量及高剂量组大鼠血清HA、LN、PCⅣ、Ⅳ-C均无显著差异,差异无统计学意义（P>0.05）。2.3红背叶根对大鼠血液流变学指标的影响：与假手术组比较,模型组、大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组大鼠全血黏度150/s切变率、30/s切变率、5/s切变率、1/s切变率及红细胞压积均显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较,大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组大鼠全血黏度150/s切变率、30/s切变率、5/s切变率、1/s切变率及红细胞压积均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）；与大黄蟅虫丸组比较,红背叶根低剂量及高剂量组大鼠全血黏度150/s切变率、30/s切变率、5/s切变率、1/s切变率及红细胞压积均无显著差异,差异无统计学意义（P>0.05）。3.免疫组化结果TGF-β1在假手术组中几乎无表达,在各造模组中大鼠的肾小管上皮细胞、肾小球和肾间质成纤维细胞中均有不同程度的表达,表现为黄褐色颗粒状沉积,模型组尤为明显,半定量分析显示：模型组、大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组肾组织中TGF-β1表达均增强,与假手术组比较显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较,大黄蟅虫丸组、红背叶根低剂量及高剂量组均显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）；与大黄蟅虫丸组相比较,红背叶根低剂量及高剂量组均无显著性差异,差异无统计学意义（P>0.05）。结论红背叶根能显著减轻肾间质纤维化大鼠的肾组织损害,保护肾小管上皮细胞,降低肾组织纤维化程度,改善肾间质纤维化大鼠血清BUN、Scr、HA、LN、pcⅢ、Ⅳ-C指标,降低肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-β1的表达,对肾间质纤维化大鼠起保护作用,同时红背叶根能改善肾间质纤维化大鼠血流变指标,对微循环起改善作用,提示活血化瘀可能是其药物功效之一。
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