条锈菌诱导的小麦抑制差减杂交文库构建（SSH）及其表达序列标签（ESTs）研究

论文摘要

由Puccinia striiformis f. sp. Tritici引起的小麦条锈病是我国小麦生产上最重要的病害之一,它分布广、传播快、危害大。选育并合理利用抗病品种是防治麦类锈病最为经济而有效的措施之一。然而,由于条锈菌毒性变异频繁,新的毒性小种不断出现,往往导致小麦品种抗锈性丧失,这已成为抗病品种应用中一个突出的问题。开展小麦与条锈菌互作的分子机理研究,不但可以揭示病原物的致病机理和寄主植物的抗病机制,而且对小麦抗条锈品种的合理利用及病害的可持续控制具有重要的理论和实际意义。本研究利用抑制差减杂交技术构建了条锈菌诱导的小麦叶片cDNA文库,对文库中序列进行了功能注释和分类,初步探明了条锈菌诱导后小麦的基因表达情况,并对筛选到的抗病相关基因进行了克隆,为从分子水平阐明小麦的抗病机制奠定了基础。本论文主要包括以下几方面内容:1.采用4种方法对小麦不同器官的总RNA进行了提取。比较后发现NaAC/无水乙醇沉淀法适于小麦各器官总RNA的提取,具有沉淀时间短、产量高、操作简便、价格便宜等优点;不同器官的总RNA以小麦乳熟期籽粒中含量最高;研究表明小麦叶片的rRNA组成比较复杂,除含有细胞质25S和18S rRNA,还存在大量的叶绿体23S、16S和9S rRNA。2.本研究以小麦品种水源11和条锈菌CY23为试验材料,构建了接种后24 h、48 h、72 h混合的小麦叶片非亲和SSH文库。对文库中包含的2 606个阳性克隆提取质粒并测序,共得到2 167条高质量ESTs。经Cap3软件聚类后获得652个Unigenes,包括333个Contigs和319个Singlets。功能注释和分类后发现,在已知功能的Unigenes中,以能量和基础代谢类最多,占27%;抗病与防御类、膜和转运类基因分别占11%和10%;信号转导类、氨基酸合成加工类各占4%;次生代谢类占3%;DNA和RNA结合类、转录和翻译类分别占2%和1%;还有34%的未知功能Unigenes,包括未知功能蛋白和在非冗余蛋白数据库中无显著匹配的序列。3.对SSH文库中获得的抗病相关基因进行了分析,推测锌指蛋白、苯丙氨酸解氨酶、抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶和甘氨酸脱羧酶等参与了小麦的主要抗病过程;过敏性反应诱导蛋白、伤诱导蛋白、胁迫反应蛋白、铁缺乏诱导蛋白等可能也在抗病过程中发挥作用。对信号转导相关基因分析后发现,GTP结合蛋白、Ran结合蛋白、MAP激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、丙酮酸脱氢酶激酶、信号识别颗粒蛋白等可能参与了抗病信号转导过程;1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）和S-酰苷甲硫氨酸合成酶在SSH文库中同时存在,推测乙烯信号途径可能也参与启动抗病防卫反应过程。对文库中转运相关基因分析发

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 小麦条锈病的危害及研究现状
• 1.1.1 小麦条锈病的危害
• 1.1.2 小麦条锈病的研究现状
• 1.2 植物抗病的分子机制
• 1.2.1 植物抗病基因研究进展
• 1.2.2 植物过敏性反应研究进展
• 1.2.3 植物系统获得抗病性（SAR）研究进展
• 1.2.4 植物抗病基因介导的信号途径
• 1.3 差减杂交技术、表达序列标签技术及其应用
• 1.3.1 差减杂交技术
• 1.3.2 表达序列标签（ESTs）技术
• 1.4 生物信息学与ESTS 研究
• 1.4.1 生物信息学的产生和定义
• 1.4.2 生物信息学的国内外研究现状
• 1.4.3 生物信息学数据库的特点
• 1.4.4 生物信息学在ESTs 研究中的应用
• 1.5 实时荧光定量PCR 技术
• 1.5.1 PCR 技术从定性到定量的飞跃
• 1.5.2 实时荧光定量PCR 技术原理
• 1.5.3 荧光化学
• 1.5.4 定量方法
• 1.5.5 荧光定量PCR 技术在植物上的应用
• 1.6 本研究的目的及意义
• 1.7 技术路线
• 第二章 小麦不同器官总RNA 含量及不同提取方法的比较
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 生化试剂
• 2.1.2 试验仪器
• 2.1.3 植物材料
• 2.1.4 小麦叶片总RNA 提取
• 2.1.5 总RNA 中基因组DNA 的去除
• 2.1.6 小麦叶片总RNA 的浓度及纯度检测
• 2.1.7 小麦叶片总RNA 的完整性检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 小麦叶片总RNA 浓度及纯度检测
• 2.2.2 不同器官总RNA 完整性检测
• 2.3 结论与讨论
• 第三章 条锈菌诱导的小麦SSH 文库构建及ESTS 大规模生物信息学分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器与试剂
• 3.1.2 供试菌种和小麦品种
• 3.1.3 接种和培养
• 3.1.4 取样量及取样时间
• 3.1.5 总RNA 提取与mRNA 分离纯化
• 3.1.6 抑制差减杂交
• 3.1.7 PCR 产物的纯化
• 3.1.8 PCR 产物的载体连接反应
• 3.1.9 感受态细胞的制备及连接产物的转化
• 3.1.10 文库重组率检测
• 3.1.11 文库片段大小检测
• 3.1.12 大规模质粒提取
• 3.1.13 序列测定
• 3.1.14 序列分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 总RNA 提取结果
• 3.2.2 RNA 浓度及纯度测定
• 3.2.3 mRNA 质量检测结果
• 3.2.4 抑制差减杂交检测结果
• 3.2.5 SSH cDNA 文库质量评价及测序结果
• 3.2.6 ESTs 获得与分析
• 3.3 结论与讨论
• 3.3.1 高质量RNA 是构建高质量文库的基础
• 3.3.2 SSH 文库的质量检测
• 3.3.3 SSH 技术的优缺点
• 3.3.4 小麦接种条锈菌初期参与抗病过程的相关基因
• 第四章 小麦抗病相关基因的表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 小麦材料
• 4.1.2 生化试剂及仪器
• 4.1.3 菌株
• 4.1.4 小麦叶片总RNA 的提取
• 4.1.5 四条抗病相关ESTs 的反转录PCR 表达情况分析
• 4.1.6 三条抗病相关基因的荧光定量检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 反转录PCR 验证抗病相关基因的表达情况
• 4.2.2 荧光定量PCR 检测抗病相关基因的表达模式
• 4.3 结论与讨论
• 第五章 两条小麦抗病相关基因的克隆及其生物信息学分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 两个小麦抗病相关基因的电子克隆及分析
• 5.1.2 两个抗病相关基因的RACE 全长克隆及分析
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 抗病性相关基因的电子克隆
• 5.2.2 RACE 全长基因及其生物信息学分析
• 5.3 结论与讨论
• 5.3.1 电子克隆技术应用于小麦基因克隆的可行性及其优缺点
• 5.3.2 RACE 技术的优缺点
• 5.3.3 过敏性反应诱导蛋白
• 5.3.4 神经鞘氨醇酶
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介