HIV-1 Tat分子的改造、原核表达、纯化和免疫学分析

论文摘要

人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）即艾滋病病毒感染是目前严重威胁人类健康和社会稳定的严重传染病之一。为降低感染者的发病率以避免更多的人感染HIV病毒,研制有效的HIV疫苗成为HIV防治的重要手段之一。HIV分为1型和2型,其中HIV-1目前流行最为广泛。HIV-1 Tat（trans-activator of transcription）蛋白是病毒产生的重要调控蛋白和致病因子,在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶细胞后,细胞质中合成的Tat可进入细胞核,与HIV-1新生RNA的反式激活效应元件（transactivating responsive region ,TAR）结合促进其延长,反式激活HIV-1 RNA的转录,从而激活HIV-1的增殖。此外,Tat还可被感染细胞分泌到胞外发挥多种细胞外作用并在致病中起重要作用。因此,阻断Tat分子对病毒复制的影响以及细胞外毒性作用,是制备预防性和治疗性的Tat疫苗的主要依据。原核表达制备的Tat蛋白具有相对稳定的空间构象,所诱导的抗体具有较高的抗体滴度和较好的中和活性,但是其表达量较低,限制了Tat蛋白的大规模制备。化学合成制备的蛋白具有纯度高、产量大的优势,但该方法制备的Tat蛋白构象不够稳定,所诱导产生的抗体滴度低,中和活性也较差。因此,提高Tat蛋白的原核表达量、稳定性和免疫原性对于Tat疫苗的制备具有重要意义。本研究分以下四部分进行:一.HIV-1型HXB2株Tat（1-101aa）蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和免疫原性分析根据大肠杆菌偏好密码子优化后的HIV-1型HXB2株Tat DNA序列设计引物,用重叠延伸PCR方法合成HIV-1 Tat DNA编码序列,用T/A克隆法将其插入pMD-18T载体进行测序。将Tat DNA克隆至原核表达载体pET32a,构建其原核表达质粒pET32a-Tat（1-101aa）,转入E.coli BL21（DE3）中IPTG诱导表达出相对分子量为31 000的融合蛋白,并用Ni-NTA亲和层析法纯化表达蛋白,纯化后目的蛋白浓度为1.50mg/ml。PET32a-Tat（1-101aa）蛋白免疫家兔,ELISA方法对抗血清进行免疫学分析,结果表明可产生效价为1:640 000的抗体且特异性针对Ta（t1-101aa）蛋白。二.HIV-1型HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的分段表达、纯化和免疫原性分析原核表达的Tat蛋白浓度偏低,为了寻找对表达产生影响的原因和其重要的抗原表位,根据所包含功能区的不同,将Tat蛋白划分为三个区域（1-48位氨基酸,22-72位氨基酸,38-101位氨基酸）分段进行原核表达。用PCR方法获得Tat（1-48aa）,Tat（22-72aa）和Tat（38-101aa）DNA片段,构建其原核表达质粒pET32a-Tat（1-48aa）,pET32a-Tat（22-72aa）和pET32a-Tat（38-101aa）,并转入E.coli BL21（DE3）中,IPTG诱导表达出相对分子量分别为23 000、23 000和25 000的融合蛋白, Ni-NTA亲和层析法纯化后其浓度分别为4.26mg/ml、3.35 mg/ml和5.11mg/ml。ELISA法检测三种目的蛋白PET32a-Ta（t1-48aa）,PET32a-Tat（22-72aa）和PET32a-Tat（38-101aa）与兔抗PET32a-Tat（1-101aa）抗血清均呈特异性结合,其抗体滴度分别为1:128 000、1:32 000、1:64 000,而与PET32a蛋白仅有较弱结合。说明半胱氨酸富集区（22-37位氨基酸）对Tat蛋白的原核表达有较显著影响;Tat蛋白的N端区、碱性区和C端区是其重要的抗原表位,其中N端区的免疫原性最强。三.缺失半胱氨酸富集区的HIV-1型HXB2株Tat蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化和免疫原性分析为提高Tat蛋白在大肠杆菌中的表达量和分子稳定性以及开发HIV Tat疫苗的新型免疫原,用PCR方法对Tat蛋白的半胱氨酸富集区（22-37位氨基酸）进行缺失突变,获得Tat（△C）DNA序列,克隆至pMD18-T载体中进行测序鉴定。鉴定正确的序列克隆构建其原核表达质粒pET32a-Tat（△C）。pET32a-Tat（△C）质粒和pET32a-Tat（1-101aa）质粒相同条件下转入E.coli BL21（DE3）中分别诱导表达出相对分子质量为29 000的和31 000的融合蛋白,Ni-NTA亲和层析法纯化后目的蛋白浓度分别为7.12mg/ml和1.50mg/ml,缺失半胱氨酸富集区后Tat蛋白原核表达量明显提高。原核表达后立即纯化的PET32a-Tat（1-101aa）蛋白就有二聚体的形成,而PET32a-Tat（△C）蛋白则无二聚体形成。进一步将PET32a-Tat（1-101aa）和PET32a-Tat（△C）蛋白分别置于25℃和4℃存放7天后,PET32a-Tat（1-101aa）蛋白出现了明显的二聚体,而PET32a-Tat（△C）蛋白则无二聚体的形成,说明缺失半胱氨酸富集区后Tat蛋白稳定性得到提高。用PET32a-Tat（△C）融合蛋白免疫家兔制备抗血清,ELISA和Western-blot方法对抗血清进行免疫学分析。PET32a-Tat（△C）蛋白免疫家兔可诱导产生高滴度的抗体（1:320 000）,该抗体与Tat（△C）蛋白、Tat（1-101aa）蛋白及化学合成Tat（1-86aa）蛋白均呈特异性和交叉性反应。四.不同Tat抗原检测HIV-1型感染者血清抗体的比较用原核表达的PET32a-Tat（1-101aa）蛋白、PET32a-Tat（△C）蛋白和化学合成Tat（1-86aa）蛋白检测与HIV-1型感染者血清的结合反应,分析比较其检测的阳性率和结合反应的特异性,筛选出最佳抗原用于临床检测。PET32a-Tat（△C）抗原检测HIV-1感染者血清阳性率达到13.5%,明显高于同时比较的另外两种抗原;ELISA反应中PET32a-Tat（△C）抗原与HIV-1感染者血清结合反应阳性的A450平均值为0.193,高于同时比较的另外两种抗原;PET32a-Tat（△C）抗原与HIV-1感染者血清结合反应阴性的A450平均值为0.024,低于同为原核表达的PET32a-Tat（1-101aa）抗原。说明PET32a-Tat（△C）蛋白与HIV-1感染者血清结合反应性最强且缺失半胱氨酸富集区后降低了其与HIV-1感染者血清中Tat抗体的非特异性结合。本研究寻找出对Tat蛋白原核表达有影响的区域——半胱氨酸富集区,并成功构建了缺失半胱氨酸富集区的Tat蛋白的原核表达质粒pET32a-Tat（△C）。缺失半胱氨酸富集区后,Tat蛋白的原核表达水平和稳定性都获得明显提高,保留了其免疫原性并获得一定的交叉反应性。PET32a-Tat（△C）抗原与HIV-1感染者血清结合反应性最强且缺失半胱氨酸富集区后降低了其与HIV-1感染者血清中Tat抗体的非特异性结合。这不仅为开发新一代的HIV Tat疫苗提供了可能的新型免疫原,也为Tat蛋白的结构和功能研究提供了一种新的模式分子。

论文目录

• 英文缩写
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 HIV-1 型 HX82 株 Tat 蛋白（1-101aa）在大肠杆菌中的表达、纯化和免疫原性分析
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第二部分 HIV-1 HX82 株 Tat 蛋白在大肠杆菌中的分段表达、纯化和免疫原性分析
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第三部分 缺失半胱氨酸富集区的 HIV-1 HX82 株 Tat 蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和免疫原性分析
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 第四部分 不同Tat 抗原检测 HIV-1 感染者血清抗体的比较
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录 个人简历
• 致谢
• 综述
• 参考文献