大鼠ZFP580基因的克隆与原核表达

论文摘要

目的:克隆和分析ZFP580基因cDNA开读框架全编码区（编码172个氨基酸）、N端编码区（编码1-88位氨基酸）、C端C2H2型锌指主构域编码区（编码89-172位氨基酸）。构建ZFP580基因原核表达载体并鉴定,诱导表达GST-ZFP580融合蛋白。方法:1从正常大鼠小脑组织中提取总RNA。2根据GenBank公布的大鼠ZFP580基因cDNA开读框架序列设计引物,用RT-PCR的方法扩增ZFP580基因cDNA开读框架以及ZFP580基因的N端编码区和C端编码区。3用T-A克隆方法将目的基因克隆至pMD18-T-Easy载体中,挑取琼脂板上的白色菌落,接种于5ml含有Amp的LB液体培养基中,37℃摇菌培养过夜。用碱裂解法小剂量制备重组质粒。采用BglII和XhoI双酶切法、PCR法及测序法鉴定重组质粒。构建成功的阳性重组质粒记作pMD18-T-ZFP580。同法成功克隆ZFP580基因N端编码区和C端编码区,阳性重组质粒记作pMD18-T-N、pMD18-T-C。4用BglII和XhoI对克隆载体pMD18-T-ZFP580和原核表达载体pET-42a（+）分别进行双酶切,琼脂糖凝胶电泳酶切产物,纯化回收带有粘端的ZFP580基因和pET-42a（+）载体。将ZFP580基因和pET-42a（+）表达载体用T4DNA连接酶连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细胞,加LB液体培养基,37℃培养60min。将菌液均匀涂布于含Kan的LB琼脂平板上,于37℃培养箱中培养12-16h。挑取琼脂板上的单菌落,接种于5ml含有Kan的LB液体培养基中,37℃摇菌培养过夜。用碱裂解法小剂量制备质粒进行鉴定。阳性重组质粒记作pET-42a-ZFP580。同法成功构建ZFP580基因的C端编码区,阳性重组质粒记作pET-42a-C。阳性重组质粒用双酶切的方法鉴定并双向测序,确认有无读码框错误。5阳性重组载体pET-42a-ZFP580转化E.coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,优化表达条件,确定最佳表达参数,SDS-PAGE分析鉴定GST-ZFP580蛋白的表达。6生物信息学分析ZFP580基因结构和功能。结果:1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳呈现清晰的28S和18S两条带,并且28S宽度以及亮度是18S的2倍,5S量较少。证实所提取总RNA完整性高。测OD260/OD280比值1.9左右,证明总RNA纯度高,无蛋白质和酶等抑制物残留。2 RT-PCR扩增后,在519bp附近出现了一条特异性条带,此DNA条带与大鼠ZFP580基因cDNA开读框架全编码区的大小相符合。测序证明已获得ZFP580基因开读框架,其序列与GenBank中预测序列完全一致。同法获得264bp和252bp大鼠ZFP580基因的N端编码区和C端编码区。序列比对结果证实与GenBank中预测的一致。3 T-A克隆构建获得的阳性克隆载体pMD18-T-N、pMD18-T-C、pMD18-T-ZFP580,用Bgl II和Xho I双酶切和PCR法鉴定。结果表明,上述三个克隆载体已成功构建。4原核表达载体pET-42a-ZFP580、pET-42a-C经鉴定证实构建成功。测序证实pET-42a-ZFP580载体无读码框的错误,转化入表达菌株E.coli BL21（DE3）, IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定分析GST-ZFP580融合蛋白表达情况。5小剂量多次进行蛋白表达实验,未能诱导表达目的蛋白。深入探讨了未能表达目的蛋白的原因。6大鼠ZFP580基因cDNA全长1100bp,完整开读框架为519bp,编码一个含有172个氨基酸的蛋白质,所编码的蛋白与锌指蛋白相似有2个功能结构域:N端的富含脯氨酸结构域和C端的3个C2H2型锌指结构。结论:1大鼠ZFP580基因cDNA开读框架全编码区、大鼠ZFP580基因的N端编码区和C端编码区与GenBank中预测序列完全一致。2成功构建克隆载体pMD18-T-N、pMD18-T-C、pMD18-T- ZFP580和原核表达载体pET-42a-ZFP580、pET-42a-C。3原核表达载体pET-42a-ZFP580读码框正确无误,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析表达情况。小剂量多次进行蛋白表达实验,未能诱导表达目的蛋白。4详细分析大鼠ZFP580基因结构和功能,大鼠ZFP580基因开读框架编码一个含有172个氨基酸的蛋白质,所编码的蛋白与锌指蛋白相似有2个功能结构域。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 研究论文 大鼠ZFP580 基因的克隆与原核表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 氧化型低密度脂蛋白的形成及其致动脉粥样硬化的机制
• 致谢
• 个人简历