猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白CTL表位的筛选与鉴定

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome ,PRRS）是危害养猪业最重要的病毒性传染病之一,严重阻碍了世界养猪业的发展。由于PRRSV的变异与重组、病毒的ADE（Antibody-dependent enhancement）特性以及其主要侵害免疫系统等因素,致使现有疫苗难以有效控制该病的发生。为控制该病的蔓延,各国学者纷纷致力于新型疫苗的研发,但成果甚微。关于PRRS的免疫机制,目前尚缺乏系统的了解,尤其是有关该病细胞免疫方面的研究不过深入,这导致我们对其免疫机制缺乏全面了解。对于大多数病毒性疾病,细胞免疫在清除病毒感染方面的作用不容忽视。细胞毒性淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）是机体有效控制各种病毒感染及抗肿瘤、抗移植物的免疫细胞之一。在病毒感染时,MHC I类分子限制性的抗原特异性CTL反应是清除病毒、控制病毒复制和扩散的主要机制。研究证实,PRRSV感染后可以诱发机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答,尤其是近来的研究表明,细胞免疫在清除机体PRRSV感染方面可能起着更重要的作用,这为我们进一步研究PRRS的细胞免疫机制提供了理论依据。研究发现PRRSV具有3个重要的结构蛋白:GP5蛋白、M蛋白和N蛋白。其中PRRSV M蛋白是PRRSV的膜基质蛋白,也是北美洲型和欧洲型分离毒株中最为保守的结构蛋白。M蛋白具有很强的免疫原性,可诱导机体产生一定的中和抗体和特异性细胞免疫应答。这表明,PRRSV M蛋白在PRRSV与机体相互作用的过程中扮演着十分重要的角色,因此本研究选其为研究对象。CTL细胞表位是指胞内抗原经抗原递呈细胞（Antigen presenting cells, APC）加工后与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）I类分子结合,并共同被特异性递呈给T细胞受体（T cell receptor,TCR）从而引起CTL免疫应答的短肽。确定CTL细胞表位对研究病毒感染的细胞免疫机制、发病机制、免疫应答机制以及研制多肽疫苗和基因疫苗等具有重要意义。至今,未见关于PRRSV CTL表位的研究报道。本研究采用SOE技术将PRRSV CH-1a株M蛋白基因与小鼠泛素基因进行融合并克隆构建DNA疫苗pVAX1-M与pVAX1-U-M;同时构建了表达M蛋白的WR株牛痘病毒的重组毒rWR-PRRSV-M;然后按照Priming-Boosting策略免疫Balb/c小鼠,然后分离小鼠脾淋巴细胞,用生物信息学方法预测、合成的CTL肽段进行体外共培养刺激,利用胞内细胞因子染色（Intracellular cytokine staining, ICS）与酶联免疫斑点技术（enzyme linked immunospot assay, ELISPOT）筛选鉴定CTL细胞表位。ICS和ELISPOT结果表明经短肽K93FITSRCRL、F57GYMTFVHF及PMA和IONO组合刺激的小鼠脾淋巴细胞孔均能检测到分泌IFN-γ的阳性细胞,而不经刺激的小鼠脾淋巴细胞与经不相关肽刺激的小鼠脾淋巴细胞却检测不到分泌IFN-γ的阳性细胞。这说明短肽K93FITSRCRL与F57GYMTFVHF均能有效的刺激记忆性的CD8+ T淋巴细胞增殖分化并分泌IFN-γ。方差分析结果表明,小鼠脾淋巴细胞经短肽K93FITSRCRL、F57GYMTFVHF刺激后,分泌IFN-γ的CD8+ T淋巴细胞数量与其它肽段所刺激的结果相比较差异极显著（P<0.01）。本研究最终鉴定出K93FITSRCRL与F57GYMTFVHF两个CTL表位,这两个CTL表位分别是H-2Kd和H-2Dd限制性的表位。PRRSV M蛋白CTL表位的鉴定将为PRRS细胞免疫机制及新型表位肽疫苗的研究奠定一定的理论基础,同时对PRRS防控技术的研究有一定的指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 PRRSV 的研究进展
• 1.1.1 历史渊源
• 1.1.2 病毒特性
• 1.1.3 基因组特征
• 1.1.4 有关PRRS 的免疫研究进展
• 1.1.4.1 PRRS 免疫是一把“双刃剑”
• 1.1.4.2 抗体依赖增强作用是疫苗研制的一大障碍
• 1.1.4.3 PRRSV 的免疫调节和免疫逃逸
• 1.1.4.4 细胞免疫可能是解决PRRSV 问题的突破点
• 1.1.4.5 我国的流行情况及危害
• 1.1.4.6 疫苗研究进展
• 1.2 细胞表位的研究进展
• 1.3 T 细胞表位的研究方法
• 1.3.1 T 细胞表位的预测方法
• 1.3.2 CTL 表位的检测方法
• 1.4 研究目的和意义
• 第二章 PRRSV M蛋白CTL表位的鉴定
• 2.1 PRRSV M 蛋白的原核表达及其DNA 疫苗的构建
• 2.1.1 材料和方法
• 2.1.2 结果
• 2.2 表达PRRSV M 蛋白重组牛痘病毒的构建及鉴定
• 2.2.1 材料和方法
• 2.2.2 结果
• 2.3 PRRSV M 蛋白CTL 表位的预测、筛选及化学合成
• 2.4 Priming-Boosting 策略对BALB/c 小鼠的免疫及检测结果
• 2.4.1 试验材料
• 2.4.2 试验技术路线及方法
• 2.4.3 结果
• 2.5 讨论
• 第三章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历