猪伪狂犬病病毒Fa株糖蛋白gD基因的分子克隆、原核表达及核酸疫苗免疫效力研究

论文摘要

本研究以猪伪狂犬病毒（PRV）Fa株的毒种为材料,扩增克隆gD基因,同时利用所获得的目的基因进行原核表达载体构建、表达及真核表达载体构建及免疫效力的研究,主要研究内容如下:1.gD基因的分子克隆与序列分析参照GenBank中登录号为AY217094的PRV Fa株的gD基因序列,利用Olig06.0和Premier软件辅助设计1对引物,以Vero细胞增殖培养的PRV为材料,采用PCR技术扩出gD基因,用TA克隆法连接到pMD18-T-vectot载体上,构建克隆重组质粒pMD-gD。并将阳性菌送公司测序,序列测定显示,克隆出1245bp片段,包含1个1209bp的ORF框,编码402个氨基酸。将测序结果及推导的氨基酸序列与国内外的不同来源的12个毒株进行生物学信息比较分析,克隆的gD基因核苷酸序列同源性在98.2%～99.6%,氨基酸同源性在96.3%～98.8%,不同的PRV毒株间的gD基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。2.gD基因原核表达载体构建及活性检测为了扩增出去信号肽的gD基因（gD-n）,重新设计1对引物,以pMD-gD为材料,采用PCR技术扩出目的基因,用TA克隆法连接到pMD18-T-vector载体上,构建克隆重组质粒pMD-gD-n,将酶切鉴定正确的阳性菌送公司测序,测序结果与模板中去掉信号肽的对应序列完全一致。用EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶切下目的基因（gD-n）,再定向连接到pET32a+中,获得重组原核表达载体pET-gD-n。酶切鉴定正确后转化到高效表达菌株E.coliBL21（DE3）进行表达研究。经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测显示,约在63.8KDa处出现一条特异表达带,原核重组表达载体pET-gD-n表达出与预期推测的融合目的蛋白,Western Blot检测显示表达的去信号肽融合目的蛋白具有特异的反应原性。3.gD基因核酸疫苗构建及其免疫效力的研究以pMD-gD为材料,用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶切下目的基因,再定向连接到真核表达载体pcDNA3.1（+）、pCI-neo中,再用相同的内切酶酶切鉴定,成功构建重组真核表达载体pcD-gD,pCI-gD。本实验将PRV gD基因的2个核酸疫苗pcD-gD,pCI-gD和细胞因子IL-15的表达质粒免疫小鼠,肌注免疫Balb/c小鼠两次,于首免后第2、4、6、8周采2份血样,一份分离血清,做间接ELISA抗体检测和中和抗体检测;一份加抗凝剂,做外周血CD4+,CD8+T淋巴细胞的测定。与空白和空载体比较,构建的2个真核表达载体都诱导小鼠产生PRV的特异性IgG抗体和中和抗体,第2次加强免疫后,抗体得到明显的提高,整个实验过程产生的抗体没有超过阳性对照灭活PRV组的水平。但是整个抗体水平相对稳定,提示DNA疫苗诱导的抗体维持时间较长。重组真核表达载体pcD-gD,pCI-gD刺激机体产生CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞方面较为显著,与阳性对照没有明显的差异。攻毒保护实验进一步证实构建的基因疫苗能够抵抗病毒攻击。可见构建的核酸疫苗能够产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。将细胞因子IL-15的表达质粒与pcD-gD,pCI-gD联合免疫,结果表明抗体水平和细胞免疫水平明显高于单独免疫组,特别是能显著增强重组质粒引起的CD8+T淋巴细胞的含量。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 伪狂犬病病毒研究进展
• 1.1 猪伪狂犬病流行特点
• 1.2 临床症状及病理变化
• 1.3 发病机理
• 1.4 宿主抗PRV感染的几种免疫保护策略
• 1.5 PRV病毒逃逸宿主机体免疫系统的几种策略
• 1.6 病毒分子生物学
• 1.7 PRV新型疫苗研究进展
• 2 核酸疫苗研究进展
• 2.1 核酸疫苗发现
• 2.2 核酸疫苗免疫应答
• 2.3 核酸疫苗做为治疗性疫苗的的前景
• 2.4 免疫佐剂的研究
• 2.5 注射途径及方法
• 2.6 核酸疫苗的构建
• 3 gD基因与免疫学意义
• 第二章 猪伪狂犬病毒gD基因的分子克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 毒株、细胞、菌株及试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要溶液配制
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 PRV的增殖
• 1.2.2 PRV病毒DNA的提取
• 1.2.3 特异性引物设计
• 1.2.4 聚合酶链反应（PCR）扩增gD基因
• 1.2.5 扩增产物电泳鉴定
• 1.2.6 目的片段克隆载体构建
• 1.2.7 重组质粒转化感受态细胞
• 1.2.8 转化菌落的鉴定
• 1.2.9 核苷酸序列的测定及分析
• 2 结果
• 2.1 PCR扩增目的基因电泳鉴定
• 2.2 重组克隆质粒pMD-gD酶切鉴定
• 2.3 序列测定结果分析
• 2.3.1 序列测定
• 2.3.2 核苷酸序列同源性比较
• 2.3.3 推导氨基酸同源性比较
• 第三章 PRV-gD基因原核表达和活性检测
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 质粒、菌株及主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要溶液的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 原核表达引物设计
• 1.2.2 PRV gD基因去信号肽亚克隆
• 1.2.3 PCR扩增产物电泳鉴定
• 1.2.4 目的片段的回收连接转化
• 1.2.5 重组质粒的酶切鉴定
• 1.2.6 测序验证
• 1.2.7 原核表达载体构建
• 1.2.8 重组质粒转化
• 1.2.9 重组质粒pET-gD-n的酶切鉴定
• 1.2.10 重组表达菌株的培养及表达
• 1.2.11 SDS-PAGE电泳
• 1.2.12 表达产物的免疫印迹
• 2 结果
• 2.1 gD基因去信号肽（gD-n）的PCR扩增
• 2.2 重组克隆质粒pMD-gD-n的酶切鉴定
• 2.3 去信号肽gD基因序列测定结果
• 2.4 重组原核表达载体pET-gD-n的酶切鉴定
• 2.5 SDS-PAGE分析gD基因去信号肽的蛋白表达
• 2.6 Western blot分析
• 3 讨论
• 第四章 真核表达载体构建及免疫效力研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要溶液配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 真核表达载体的构建
• 1.2.2 转化及鉴定
• 1.2.3 免疫效力研究
• 2 结果
• 2.1 真核表达载体pcD-gD、pCI-gD酶切鉴定
• 2.2 ELISA检测特异性抗体
• 2.3 中和抗体分析
• 2.4 T淋巴细胞亚类数量测定
• 2.5 攻毒保护实验
• 3 讨论
• 3.1 载体的选择
• 3.2 基因疫苗质粒的纯化
• 3.3 免疫接种途径的选择
• 3.4 核酸疫苗诱导机体体液免疫反应
• 3.5 T淋巴细胞水平与机体免疫状况
• 3.6 攻毒后的保护情况
• 3.7 IL-15表达质粒对核酸疫苗增强作用
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附图
• 攻读学位期间发表的学术论文目录