论文摘要
志贺氏菌病是世界上尤其是发展中国家重要的传染病之一,福氏2a血清型是我国志贺氏菌病流行的优势菌型。目前,志贺氏菌病尚缺乏有效预防方法,一般主张抗菌治疗。但是细菌对已有药物的耐药性越来越普遍,并出现多重耐药,这给临床防治工作带来极大困难,因此开发新型抗菌药物尤为重要。本课题以DNA微阵列技术平台为基础,以福氏志贺菌为研究模型,获得抗菌药物的转录谱,并根据生物信息学方法分析药物潜在作用机制,从而为志贺氏菌病新药物靶标研究提供线索,为新型抗菌药物开发提供依据。课题在本实验室独立完成的福氏2a血清型301株(Sf301)全基因组序列测定及功能基因组注释的基础上,大批量设计ORF特异性的引物进行PCR扩增。PCR扩增产物经纯化和定量后用于制备微阵列。除去因扩增产物太小或无特异性引物等原因没有成功扩增的开放读码框,最终共获得3771个基因组染色体编码的ORFs和113个质粒编码的ORFs,分别占基因组染色体和质粒总ORF的93.3%和72.9%。本课题检测了Sf301对呋哺唑酮(FZ)和盐酸小檗碱(BBR)的敏感性。根据NCCLS推荐的常量肉汤稀释法,测定FZ和BBR对Sf301的最低抑菌浓度分别是32μg/ml和640μg/ml。通过观察细菌在药物作用下的生长曲线,我们发现BBR不仅能够抑制细菌生长,还具有杀菌作用。本课题选用亚抑菌浓度和短孵育时间进行药物转录谱研究。与空白对照组相比,我们发现FZ导致295个基因表达发生显著改变。其中,有150个基因的表达水平上调,145个基因表达下调。根据蛋白质直系同源簇数据库(简称COGs),我们把差异表达的基因按照功能进行分类。许多参与能量代谢和氨基酸代谢基因的表达受到药物抑制,但是很多参与无机离子转运、辅酶代谢、翻译后修饰、次级代谢物生物合成基因表达受到药物诱导。此外,一些DNA复制和修复相关基因的转录水平也上调。这些数据表明FZ促进细菌内自由基反应并导致氧化危机。而且,FZ能够解除细菌对铁代谢调控元的抑制,这可能加重细胞的氧化损伤。除此之外,我们发现FZ影响丙酮酸代谢并抑制电子传递链的功能。BBR处理细菌后,Sf301的基因表达发生了明显改变：总共有399个基因表达水平至少变化了两倍：165个基因的表达水平上调,234个基因表达下调。进一步分析发现10.7%与细胞分裂和染色体分离相关的基因受到药物诱导,其次为核苷酸代谢和脂代谢类,均有10%左右的基因在药物处理后表达上调。蛋白质翻译和DNA复制与修复相关基因也明显受到药物诱导,分别占9.7%和8.5%。另外,大多数膜生物合成基因表达上调。与此相反,在药物处理后有9.4%糖代谢基因、8.5%能量代谢和8.5%氨基酸代谢基因表达下降,这可能与药物引起的生长抑制有关。进一步数据分析提示盐酸小檗碱抑制DNA复制和分裂,损伤DNA。盐酸小檗碱可能与细胞外膜相互作用,影响外膜完整性。此外盐酸小檗碱可能干扰一些氨酰tRNA分子的喹啉修饰,影响翻译过程。本研究提示盐酸小檗碱具有复杂的作用机制。本课题利用实时定量PCR技术对转录谱实验结果进行验证,结果表明二者之间具有高度的相关性。总之,本课题建立了分析药物潜在抗菌机制的技术平台,不仅为我们的后续工作提供基础,而且为新型抗菌药物的研发提供依据。