Cx43 RNA干扰防治脑血管痉挛的体内实验研究

论文摘要

目的:前期研究发现缝隙连接蛋白Cx43的高表达可能在脑血管痉挛中发挥重要作用,本实验在此基础上,拟采用RNA干扰的方法,从实验动物脑池内注入携带shRNA的重组腺病毒载体,特异干扰脑血管痉挛时Cx43的异常高表达,观察对脑血管痉挛的影响,进一步证实Cx43及缝隙连接在脑血管痉挛发生发展中的重要作用。并期待通过实施本研究,探讨脑血管痉挛的基因治疗途径。方法:1.构建RNA干扰腺病毒载体:将前期研究证实的兔Cx43基因特异性378siRNA片段插入空的表达载体并据此构建穿梭质粒。采用腺病毒包装系统通过共转染293细胞构建重组腺病毒载体Ad5-H1-connexin43-shRNA-GFP。2.观察腺病毒载体转染效率:单纯病毒组经脑池穿刺法将病毒注入正常兔的枕大池内,ld、3d、5d、7d及14d后处死动物,取基底动脉行荧光显微镜及光镜检测,RT-PCR、Western blotting分别测定Cx43 mRNA、蛋白表达水平;同时另设单纯溶媒组及单纯空病毒组,分别以保存病毒的溶媒及空病毒作为阴性对照。3.建立兔二次蛛网膜下腔出血模型（脑血管痉挛模型）:按照不同时相分组,在建立模型前及建立模型后的1d、3d、7d、14d行DSA造影,比较各时相基底动脉直径的变化,光镜下观察血管壁组织形态学的变化。4.检测建立模型后Cx43 mRNA及蛋白表达的变化:在建立模型1d、3d、7d、14d后,RT-PCR、Western blotting分别测定Cx43 mRNA、蛋白表达水平,并分析Cx43不同时相表达的变化与建立模型后不同时相基底动脉直径的变化是否有相关性。5.预处理组实验:设病毒预处理组、溶媒预处理组及空病毒预处理组3组。在建立二次蛛网膜下腔出血模型前5d经脑池分别给药行预处理。在建立模型前及建立模型后7d分别行DSA造影,比较前后两次造影基底动脉直径的变化,RT-PCR测定Cx43 mRNA表达水平,Western blotting测定Cx43蛋白表达水平,光镜下观察血管壁组织形态学的变化。6.处理组实验:设病毒处理组、溶媒处理组及空病毒处理组3组。均在建立二次蛛网膜下腔出血模型后30min经脑池途径分别行给药处理。在建立模型前及建立模型后7d分别行DSA造影,比较前后两次造影基底动脉直径的变化,RT-PCR测定Cx43 mRNA表达水平,Western blotting测定Cx43蛋白表达水平,光镜下观察血管壁组织形态学的变化。结果:1.构建RNA干扰腺病毒载体:鉴定毒种证实构建成功,行扩增、纯化生产,确认纯化程度在95%以上。2.腺病毒载体转染效率:1)脑池内注入病毒后1d荧光显微镜下即在基底动脉外膜层见绿荧光蛋白表达,5d时达到高峰且平滑肌层有明显表达,7d时表达较强,14d时仍有表达;2)单纯病毒组Cx43 mRNA表达及蛋白表达与正常兔相比明显降低,以5d、7d、14d尤为显著,单纯溶媒组、单纯空病毒组与正常兔相比均无明显差异;3)各组光镜下未见炎性反应。3.建立兔二次蛛网膜下腔出血模型（脑血管痉挛模型）:DSA造影显示注血后1d即出现血管狭窄,7d时达高峰,14d时缓解。光镜下可见痉挛的血管内皮细胞核染色质聚集,内弹力膜呈显著波纹状,平滑肌细胞分布稀疏,周围红染组织明显增多,核长梭形,内弹力膜与平滑肌层间有水肿。4.检测建立模型后Cx43 mRNA及蛋白表达的变化:Cx43 mRNA表达及蛋白表达在建立模型后1d、3d、7d、14d均升高,其中7d时为高峰。Cx43 mRNA及蛋白表达的时相性变化同建立脑血管痉挛模型后基底动脉直径的时相性变化相比,相关系数分别为0.968、0.912,二者同基底动脉直径的时相性变化均存在直线关系。5.预处理组实验:病毒预处理组前后两次DSA造影基底动脉狭窄与蛛网膜下腔出血组相比明显缓解（P<0.001）,Cx43 mRNA及蛋白的表达在1d、3d、7d、14d均显著低于蛛网膜下腔出血组,光镜下血管痉挛表现明显减轻;溶媒预处理组、空病毒预处理组上述指标与蛛网膜下腔出血组无明显差异。6.处理组实验:病毒处理组前后两次DSA造影基底动脉狭窄与蛛网膜下腔出血组相比明显缓解（P<0.05）,Cx43 mRNA及蛋白的表达在1d、3d与蛛网膜下腔出血组无显著差异,但7d、14d显著低于蛛网膜下腔出血组,光镜下血管痉挛表现略有减轻;溶媒处理组、空病毒处理组上述指标与蛛网膜下腔出血组无明显差异。结论:1.缝隙连接参与蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛的病理过程,并进一步证实Cx43的高表达参与了脑血管痉挛的发生发展。2.特异性RNA干扰Cx43的表达,对脑血管痉挛有预防及缓解作用,Cx43基因可能是脑血管痉挛基因治疗的重要靶点之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 第二章 实验材料与仪器
• 2.1 实验动物
• 2.2 实验试剂
• 2.2.1 主要购置试剂
• 2.2.2 主要配置试剂
• 2.3 实验仪器
• 第三章 实验方法
• 3.1 RNA 干扰腺病毒载体的构建
• 3.2 重组腺病毒载体转染效率的观察
• 3.3 体内实验的分组
• 3.4 实验动物体内CVS 模型的建立
• 3.5 测定建立模型后Cx43 mRNA 及蛋白表达的变化
• 3.6 脑基底动脉造影及血管直径的测量
• 3.7 RT-PCR 技术测定Cx43 mRNA 表达的变化
• 3.7.1 提取总RNA
• 3.7.2 总RNA 样品质量分析
• 3.7.3 逆转录
• 3.7.4 PCR 扩增
• 3.7.5 配制1.596琼脂糖凝胶
• 3.7.6 PCR 产物水平电泳
• 3.7.7 观察结果并拍照
• 3.8 Western blotting 技术测定Cx43 蛋白表达的变化
• 3.8.1 总蛋白样品制备
• 3.8.2 样品蛋白含量的测定
• 3.8.3 配制5%积层胶及8%分离
• 3.8.4 灌胶及上样
• 3.8.5 垂直电泳
• 3.8.6 转膜
• 3.8.7 目标蛋白免疫反应
• 3.8.8 目标蛋白化学发光及曝光
• 3.8.9 膜再生
• 3.8.10 内参蛋白免疫反应
• 3.8.11 内参蛋白化学发光及曝光
• 3.8.12 图像分析
• 3.9 光镜下血管壁组织形态学观察的变化
• 3.10 数据统计分析
• 第四章 实验结果
• 4.1 RNA 干扰重组腺病毒载体的构建
• 4.2 重组腺病毒载体转染效率的观察
• 4.3 动物体内CVS 模型的建立
• 4.4 建立模型后Cx43 mRNA 及蛋白表达的变化
• 4.5 预处理组实验
• 4.6 处理组实验
• 第五章 讨论
• 5.1 蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛（CVS）
• 5.2 CVS 的研究仍存在的问题
• 5.2.1 目前机制仍不明
• 5.2.2 CVS 治疗的研究有很多，但无特效或存在争议
• 5.2.3 我们的前期研究中存在的问题
• 5.3 缝隙连接（GJ）
• 5.3.1 细胞GJ 的功能
• 5.3.2 细胞GJ 功能的调节
• 5.3.3 Cx43 表达在GJ 功能变化中的作用
• 5.4 RNA 干扰（RNAi）技术及其应用
• 5.5 Cx43 在CVS 中表达变化的机制及RNAi 防治CVS 的前景
• 第六章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 综述
• 攻读学位期间的研究成果