TGF-β1siRNA对肝星状细胞生物学活性影响的实验研究

论文摘要

目的 肝纤维化是各种肝损伤的共同结果，肝星状细胞（HSC）是肝纤维化形成的细胞基础，许多细胞因子参与了肝纤维化和肝硬化的形成，，分子机理表明，在许多细胞因子参与中，转化生长因子β1（TGF-β1）在HSC的激活、细胞外基质的聚积起着非常关键的作用，RNA干扰（RNAi）是一种能达到特异性抑制目的基因表达的现象，已成功地下调了一些内源性基因的表达。我们目的是通过构建表达TGF-β1小干扰RNA（siRNAs）的psu6TGF质粒，观察其在肝星状细胞中对HSC的信号激活和胶原的影响。 方法 （1）从NCBI网站获得大鼠TGF-B1的cDNA序列，根据Ambion公司网上设计软件设计三个siRNA作用靶点，相应的双链DNA被插入pSilencer2.1-U6质粒中，即，siTGFA、siTGFB、 siTGFC；（2）以脂质体Metafectene2000转染含荧光素基因（GFP）的质粒于HSC-T6细胞中，观察转染效率：（3）为了得到高效沉默TGF-β1siRNA，利用脂质体Metafectene2000将各组siRNA 1ug，2ug，4ug，6ug，8ug转染HSC-T6细胞，观察沉默效果。然后，将最佳沉默siRNA导入HSC-T6细胞，分别在1，3，5天提取细胞mRNA和蛋白，并收集上清液；（4）RT-PCR检测TGF-β1，Ⅰ，Ⅲ型胶原，smad3、smad7的mRNA表达；（5） West-Blot检测TGF-β1和a-SMA的蛋白表达；（6）放射免疫法测细胞上清液透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型前胶原含量变化；（7）免疫组化检测Ⅰ型用胶原蛋白表达 结果 （1）表达针对TGF-β1siRNA的质粒是成功构建的：（2）脂质体转染siRNA效率达70％：（3）6ug siRNA为最佳剂量，siTGFA、siTGFB、 siTGFC，对TGF-β1mRNA的抑制率分别为60％、68％、0％；和West-Blot检测TGF-β1蛋白表达结果基本一致：（4）转染6ugsiTGFB 1，3，5天后，smad3、smad7的mHNA下调分别为0％、61％、70％和0％、15％、16％；a-SMA的蛋白表达下调分别为0％、69％、78％；Ⅰ，Ⅲ mRNA型胶原下调分别为0％、59％、66％和o％、55％、60％；Ⅰ型胶原蛋白表达明显减少；上清液透明质酸、Ⅲ型前胶原、IV型前

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、英汉缩略语名词对照表
• 四、论文正文
• 前言
• 1小干扰RNA表达质粒的建立'>第一章 抗转化生长因子-β₁小干扰RNA表达质粒的建立
• 1.1 材料与方法
• 1.2 结果
• 1.3 讨论
• 1小干扰RNA表达质粒的筛选'>第二章 高效沉默转化生长因子-β₁小干扰RNA表达质粒的筛选
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论
• 1小干扰RNA表达质粒对肝星状细胞活化和细胞外基质的影响'>第三章 TGF-β₁小干扰RNA表达质粒对肝星状细胞活化和细胞外基质的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 五、综述
• 1与肝纤维化'>综述一：TGF-β₁与肝纤维化
• 综述二：RNAi的研究进展
• 六、攻读学位期间发表的文章
• 七、致谢