α-醇溶蛋白与小麦育种

论文摘要

为了研究α-醇溶蛋白基因组成及其与小麦育种的关系,我们利用基因组PCR技术分离了158个α-醇溶蛋白基因的编码序列。其中,从二倍体长穗偃麦草（diploid Agropyron elongatum）和老芒麦（Elymus sibiricus）中获得63个α-醇溶蛋白基因的开放阅读框（ORFs）,这些序列中90%存在内部终止密码子或移码,前者主要是由于编码谷氨酰胺的密码子（CAG或CAA）发生了碱基C到T的颠换变为终止密码子（TAG或TAA）。通过分析α-醇溶蛋白基因推导的氨基酸序列发现α-醇溶蛋白是由N-端信号肽,N-端重复区,第一个多聚谷氨酰胺区,N-端非重复区,第二个多聚谷氨酰胺区和C-端非重复区六部分组成,其中除了两个变异较大的多聚谷氨酰胺区外,其他区域比较保守且序列间相似性较大:其差异主要归因于单核昔酸多态性（SNPs）、序列中的密码子的改变或移码突变。在重复区的前三个密码子中,我们发现了一些新的基序,例如GRV和RV;在第一个多聚谷氨酰胺区出现了（Q）3AR（Q）5,（Q）2AR（Q）5和（Q）3A新基序;我们也发现一些具有奇数个半胱氨酸残基的α-醇溶蛋白,并且非保守的半胱氨酸残基在N-和C-末端非重复区都存在。在二倍体长穗偃麦草的假基因中发现了一种已知的乳糜泻疾病（CD）抗原决定簇;在老芒麦的真基因中发现了两种CD抗原决定簇。系统进化树的分析表明,来自于二倍体长穗偃麦草的α-醇溶蛋白基因由若干个亚家族组成,与十倍体来源的基因聚在一起;而来自于老芒麦的α-醇溶蛋白基因则与小麦属的α-醇溶蛋白基因彼此之间具有更高的序列相似性。同时,我们从小麦体细胞杂种渐渗系Ⅱ-12及其亲本普通小麦JN177和十倍体长穗偃麦草中分离了95个α-醇溶蛋白基因的ORFs。序列比对的结果表明杂种Ⅱ-12中α-醇溶蛋白基因的组成和来源如下:（1）杂种中大多数α-醇溶蛋白基因和IN177α-醇溶蛋白基因相似;（2）小部分来自于十倍体长穗偃麦草的渐渗;（3）一些新的基因是由点突变、不等交换或者亲本基因的复制滑动所造成的。因此,我们证实了新的α-醇溶蛋白基因可能通过体细胞杂交而更快的产生,这种产生的方式与HMW-GS自然进化的机制是一致的。进一步氨基酸序列分析表明,在亲本小麦JN177和Ⅱ-12的α-醇溶蛋白基因中鉴定出了四种已知类型的CD抗原决定簇,在十倍体长穗偃麦草中只发现一种。值得注意的是虽然有相同的四种类型的CD表面抗原决定簇,但是杂种Ⅱ-12中编码CD表面抗原决定簇序列的基因数量要低于JN177,特别是在假基因中则更低。文章讨论了体细胞杂种α-醇溶蛋白与小麦育种的关系。α-醇溶蛋白中半胱氨酸的数目和位置影响面粉的品质,因此,我们选择了两个与面粉品质具有潜在相关性的基因,一个来自于老芒麦,另一个来自于Ⅱ-12,对其进行原核表达,然后构建了基于ubiquitin启动子的真核表达载体pCAMBIA3301-E42和pCAMBIA3301-Ⅱ-93,接着运用农杆菌介导的转化方法分别转化小麦株系,通过双引物PCR筛选后,初步获得了19株阳性株系,为进一步的分子鉴定、遗传分析、功能鉴定和育种应用奠定基础。从Ⅱ-12中克隆的H1Dx5基因是一个潜在的优质HMW-GS基因,利用胚乳特异的Bxl7启动子构建了该基因的真核表达载体pBIN20-H1Dx5,为今后该基因功能研究和应用于小麦育种打下了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 小麦种子储藏蛋白的组成及分类
• 1.2 小麦醇溶蛋白的染色体定位
• 1.3 α-醇溶蛋白基因的克隆及其结构
• 1.4 α-醇溶蛋白与乳糜泻疾病（CD）的关系
• 1.5 α-醇溶蛋白与小麦育种
• 1.6 小麦品质改良的研究现状
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 二倍体长穗偃麦草和老芒麦α-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 二倍体长穗偃麦草和老芒麦α-醇溶蛋白基因ORFs的克隆和测序
• 2.1.2.1 植物叶片DNA的提取
• 2.1.2.2 α-醇溶蛋白基因的基因组PCR扩增
• 2.1.2.3 PCR产物的克隆
• 2.1.2.4 阳性转化子的菌落PCR筛选
• 2.1.2.5 α-醇溶蛋白基因的序列分析
• 2.1.2.6 α-醇溶蛋白基因碱基突变分析
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 二倍体长穗偃麦草和老芒麦α-醇溶蛋白基因分离和序列分析
• 2.2.2 基于α-醇溶蛋白基因推导的氨基酸序列的特点
• 2.2.3 乳糜泻抗原决定簇位点分析
• 2.2.4 α-醇溶蛋白基因的进化关系
• 2.3 讨论
• 2.3.1 α-醇溶蛋白基因组成、拷贝数和复杂性
• 2.3.2 从获得α-醇溶蛋白基因序列看其与十倍体长穗偃麦草的进化关系
• 第三章 小麦体细胞杂种渐渗系11-12中α-醇溶蛋白基因的分子鉴定与来源研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 体细胞杂种11-12中醇溶蛋白的A-PAGE分析
• 3.1.3 α-醇溶蛋白基因ORFs的克隆和测序
• 3.1.4 所获得α-醇溶蛋白的基因序列分析
• 3.1.5 α-醇溶蛋白基因碱基突变分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 杂种中11-12中醇溶蛋白A-PAGE结果
• 3.2.2 α-醇溶蛋白基因的克隆、测序
• 3.2.3 α-醇溶蛋白基因以及推导氨基酸序列的特点
• 3.2.4 乳糜泻抗原决定簇位点分析
• 3.2.5 α-醇溶蛋白基因家族进化分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 体细胞杂种11-12中α-醇溶蛋白基因的组成和来源
• 3.3.2 杂种和双亲中α-醇溶蛋白基因碱基突变分析
• 3.3.3 杂种新α-醇溶蛋白基因对于面粉优质的贡献
• 第四章 α-醇溶蛋白基因的原核、真核表达载体的构建和转化小麦研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 原核表达载体的构建和原核表达
• 4.1.2.1 相关质粒的提取
• 4.1.2.2 目的片段两端加酶切位点PCR扩增
• 4.1.2.3 原核表达蛋白的提取及电泳分析
• 4.1.3 真核表达载体的构建
• 4.1.3.1 目的片段的准备
• 4.1.3.2 载体片段的准备
• 4.1.3.3 目的片段与载体片段的连接转化
• 4.1.3.4 阳性转化子的筛选鉴定
• 4.1.4 农杆菌介导的小麦苗端转化
• 4.1.5 转基因植株的PCR筛选
• 4.2 结果
• 4.2.1 原核表达载体构建及原核表达
• 4.2.2 真核表达载体构建
• 4.2.3 小麦转化及转基因阳性植株的鉴定
• 4.3 讨论
• 4.3.1 所选择的两个α-醇溶蛋白基因的特点
• 4.3.2 农杆菌介导转化小麦新方法——苗端转化法
• 4.3.3 谷蛋白转化的一些思考
• 第五章 杂种来源的HMW-GS 1Bx17-H1Dx5基因的真核表达载体的构建
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 所用载体和H1Dx5基因的来源
• 5.1.2 真核表达载体的构建
• 5.1.2.1 中间过渡载体的构建
• 5.1.2.2 目的片段与最终真核表达载体片段的连接
• 5.2 结果
• 5.2.1 H1Dx5基因与启动子的连接
• 5.2.2 H1Dx5基因与真核表达载体阳性转化子的筛选鉴定
• 5.3 讨论
• 参考文献
• 在读期间发表和投稿的论文:
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表