糖皮质激素影响肉仔鸡骨骼肌脂肪代谢的机制研究

论文摘要

本研究利用外源导入糖皮质激素（地塞米松）的方法,从活体和离体两个模型探讨糖皮质激素导致肉仔鸡骨骼肌脂肪代谢发生改变的机制。活体试验中,从脂肪酸摄取转运和氧化利用两个方面入手,分别研究了糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期和绝对生长高峰期骨骼肌组织脂肪沉积的影响,以及日粮脂肪酸对糖皮质激素调节效应的互作,初步探索糖皮质激素调控骨骼肌脂肪代谢的作用通路。此外通过体外成肌细胞模型,探索糖皮质激素和胰岛素两种激素对肌细胞脂肪代谢的调控,并进一步验证糖皮质激素调控肌细胞脂肪代谢的信号通路。糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响选取7d Arbor Acres雄性肉鸡,分为DEX组（DEX）、对照组（Control）和限饲组（FR）。DEX组每天皮下注射地塞米松（2.0mg/Kg体重）,自由采食和饮水;对照组注射与DEX组相同剂量的生理盐水,自由采食和饮水;限饲组注射与DEX组相同剂量的生理盐水,同时饲喂DEX组前一天的采食量。处理3d后发现,DEX处理导致肉仔鸡体增重和饲料转化率降低,骨骼肌生长受阻而脂肪含量增加,同时血浆中极低密度脂蛋白（VLDL）增加;腿肌肝型肉碱脂酰转移酶1（L-CPT1）和AMP激酶α2（AMPKα2）mRNA水平下调,表明脂肪氧化受损,DEX没有影响脂蛋白酯酶（LPL）、脂肪酸转运蛋白1（FATP1）、心型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）和长链乙酰辅酶A脱氢酶（LCAD）的mRNA水平,以及LPL和AMPK的活性;相反,限饲上调骨骼肌LPL、L-CPT1和LCADmRNA水平,腿肌FATP1、H-FABP的mRNA水平,从而促进脂肪氧化。结果显示,DEX未影响骨骼肌脂肪酸摄取但抑制其氧化。与糖皮质激素不同,限饲有利于肉鸡骨骼肌脂肪酸氧化。糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响选取35d Arbor Acres雄性肉仔鸡,分为DEX组（DEX）、对照组（Control）和采食量配对组（Pair-fed）。DEX组每天皮下注射地塞米松（2.0mg/Kg体重）,自由采食和饮水;对照组注射与DEX组相同剂量的生理盐水,自由采食和饮水;采食量配对组注射与DEX组相同剂量的生理盐水,同时饲喂DEX组前一天的采食量。处理3d后发现,饲喂状态下,DEX显著提高循环中脂肪类物质流量和骨骼肌脂肪沉积,上调腿肌糖皮质激素受体（GR）,极低密度脂蛋白受体（VLDLR）、LPL、FATP1、H-FABP、L-CPT1、LCAD与AMPKα2mRNA水平,促进胸肌GR、VLDLR、FATP1、H-FABP和LCAD的转录,同时降低了胸肌AMPKα2mRNA水平。而禁食后,DEX对血浆甘油三酯浓度、骨骼肌VLDLR、腿肌LPL、H-FABP、LCAD和AMPKα2mRNA水平均无显著影响,抑制了胸肌LPL、LCAD和AMPKα2mRNA水平,降低了骨骼肌AMPKα磷酸化和CPT1活性,且DEX对骨骼肌脂肪沉积的促进效果减弱。综上所述,DEX促进绝对生长高峰期肉仔鸡骨骼肌脂肪沉积,可能机制为脂肪酸转运率大于其氧化利用。脂肪酸对糖皮质激素调节效应的影响选取31d Arbor Acres雄性肉仔鸡,31-37d分别灌服棕榈酸（PA）、油酸（OA）和对照组（TW）。35d开始每个处理分为地塞米松注射组（DEX,2.0mg/Kg体重）和对照组（SALT）。结果发现,DEX使骨骼肌脂肪沉积增加,饱和脂肪酸可加重DEX效应,而不饱和脂肪酸有缓解作用;DEX导致骨骼肌脂肪酸转运（FATP1）与氧化利用（L-CPT1）平衡紊乱。DEX降低了腿肌AMP/ATP、AMPKα磷酸化以及AMPK活性（22.5%）,同时提高了mTOR及其下游调控子p70S6K的磷酸化,而AKT无显著变化,DEX对胸肌相关基因表达无明显影响。本试验结果表明DEX导致AMPK蛋白磷酸化受到抑制而mTOR蛋白磷酸化增强,使脂肪氧化受阻,且mTOR上调是由AMPK激活而与AKT通路无关。糖皮质激素和胰岛素对离体培养的鸡成肌细胞脂肪代谢的影响分离并培养11胚龄鸡成肌细胞,分为对照组（Control）,DEX组（DEX）,胰岛素组（INS）,地塞米松胰岛素共同处理组（DEX+INS）。处理2h后虽无统计学差异,但DEX上调AMPKα2和L-CPT1的转录,下调mTOR的基因表达,而胰岛素下调AMPKα和L-CPT1的mRNA水平。DEX与胰岛素共同作用时下调AMPKα2和L-CPT1,上调mTOR。结果表明,糖皮质激素促进脂肪氧化,而胰岛素则抑制其氧化,两者共存时表现出抑制作用。糖皮质激素和胰岛素调控鸡成肌细胞脂肪代谢的信号通路分离培养11胚龄鸡成肌细胞,分为对照组（Control）,DEX组（DEX）,AMPK抑制组（CC）,胰岛素组（INS）,AKT抑制组（LY）。培养12h后发现,DEX使GR、AMPKα2和L-CPT1转录水平显著升高,AMPK抑制剂处理后发现,AMPKα2和L-CPT1mRNA表达均与对照组相比无显著差异,而DEX导致的GRmRNA水平上升不受AMPK抑制剂的影响。相比对照组,DEX抑制了mTOR的转录,AMPK被抑制后,mTORmRNA回升到正常水平。与对照组相比,DEX组的AKT1mRNA无显著变化,而AMPK抑制剂处理提高了AKT1的转录水平。胰岛素处理显著提高了AKT1和mTOR的转录水平,AMPKα2 mRNA水平有降低的趋势,AKT抑制剂处理后,AKT1、mTOR和AMPKα2的mRNA与正常培养的成肌细胞无显著差异。结果表明,AMPK及mTOR信号通路可能参与了糖皮质激素对肌细胞脂肪摄取与氧化的调控过程,不依赖于AKT。胰岛素则可能通过AKT-mTOR及AKT-AMPK-mTOR两条信号通路来实现对肌细胞脂肪酸氧化的调控。综上所述,糖皮质激素水平升高使肉仔鸡机体能量发生动员与重新分配,从生长发育转向脂肪沉积。活体试验结果发现糖皮质激素导致肉仔鸡骨骼肌脂肪沉积增加的机制可能是脂肪酸从头合成增加,血液循环中脂肪类物质流量上升,使骨骼肌细胞内AMP/ATP降低,AMPK活性下降,mTOR信号上调,从而使脂肪氧化能力下降。同时循环中胰岛素水平的升高使AKT转录增加,但与mTOR信号上调无关。体外成肌细胞试验进一步表明,AMPK及mTOR信号通路可能参与了糖皮质激素对肌细胞脂肪摄取与氧化的调控过程,胰岛素可能通过AKT-mTOR及AKT-AMPK-mTOR两条信号通路来抑制脂肪氧化,而两者共同作用时抑制脂肪氧化。

论文目录

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前言

1.1 家禽骨骼肌脂肪代谢及其调控研究进展

1.1.1 家禽脂肪代谢特点

1.1.2 脂肪酸的合成

1.1.3 骨骼肌脂肪酸的转运摄取

1.1.4 骨骼肌脂肪酸的氧化分解

1.1.5 骨骼肌脂肪代谢的调控

1.2 糖皮质激素在家禽骨骼肌脂肪代谢的调控作用

1.2.1 糖皮质激素与应激

1.2.2 糖皮质激素与骨骼肌脂肪酸代谢

1.2.3 糖皮质激素调控骨骼肌脂肪代谢的信号通路

1.3 本研究的目的及意义

材料与方法

2.1 糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响（试验一）

2.1.1 试验动物与试验日粮

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要设备

2.1.4 缓冲液及常用试剂的配制

2.1.5 试验设计

2.1.6 测定方法

2.1.7 数据分析

2.2 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响（试验二）

2.2.1 试验动物与试验日粮

2.2.2 主要试剂

2.2.3 主要设备

2.2.4 缓冲液及常用试剂的配制

2.2.5 试验设计

2.2.6 测定方法

2.2.7 数据分析

2.3 日粮脂肪酸对糖皮质激素调节效应的影响（试验三）

2.3.1 试验动物与试验日粮

2.3.2 主要试剂

2.3.3 主要设备

2.3.4 缓冲液及常用试剂的配制

2.3.5 试验设计

2.3.6 测定方法

2.3.7 数据分析

2.4 糖皮质激素和胰岛素对离体培养的鸡成肌细胞脂肪代谢的调控（试验四）

2.4.1 试验材料

2.4.2 主要试剂

2.4.3 主要设备

2.4.4 缓冲液及试剂的配制

2.4.5 成肌细胞的提取及培养方法

2.4.6 试验设计

2.4.7 测定方法

2.4.8 数据分析

2.5 糖皮质激素和胰岛素调控鸡成肌细胞脂肪代谢的信号通路（试验五）

2.5.1 试验材料

2.5.2 主要试剂

2.5.3 主要设备

2.5.4 缓冲液及常用试剂的配制

2.5.5 成肌细胞的提取及培养方法

2.5.6 试验设计

2.5.7 测定方法

2.5.8 数据分析

结果与分析

3.1 糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响（试验一）

3.1.1 糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期生长发育及脂肪沉积的影响

3.1.2 糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期血液物质代谢的影响

3.1.3 糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢相关酶活的影响

3.1.4 糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢基因表达的影响

3.1.5 糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期骨骼肌脂肪酸组成的影响

3.2 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响（试验二）

3.2.1 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期生长发育及脂肪沉积的影响

3.2.2 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期血液物质代谢的影响

3.2.3 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢相关酶活的影响

3.2.4 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢基因表达的影响

3.2.5 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期骨骼肌脂肪酸组成的影响

3.2.6 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期空腹状态下骨骼肌脂肪沉积的影响

3.2.7 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期空腹状态下骨骼肌AMPK 蛋白磷酸化水皮的影响

3.3 日粮脂肪酸对糖皮质激素调节效应的影响（试验三）

3.3.1 糖皮质激素和脂肪酸对肉鸡生长发育及脂肪沉积的影响

3.3.2 糖皮质激素和脂肪酸对肉鸡血液物质代谢的影响

3.3.3 糖皮质激素和脂肪酸对肉鸡骨骼肌脂肪代谢相关酶活的影响

3.3.4 糖皮质激素和脂肪酸对肉鸡骨骼肌脂肪代谢基因表达的影响

3.3.5 糖皮质激素和脂肪酸对肉鸡骨骼肌脂肪沉积的影响

3.3.6 糖皮质激素和脂肪酸对肉鸡骨骼肌脂肪代谢基因蛋白水平的影响

3.4 糖皮质激素和胰岛素对离体培养的鸡成肌细胞脂肪代谢的调控（试验四）

3.4.1 鸡成肌细胞的生长情况

3.4.2 糖皮质激素和胰岛素对鸡成肌细胞脂肪代谢相关基因表达的影响

3.5 糖皮质激素和胰岛素调控鸡成肌细胞脂肪代谢的信号通路（试验五）

3.5.1 糖皮质激素对AMPK-mTOR 通路的影响

3.5.2 胰岛素对AKT-mTOR 通路的影响

讨论

4.1 糖皮质激素对肉鸡骨骼肌脂肪代谢的影响

4.1.1 糖皮质激素对肉鸡相对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响

4.1.2 糖皮质激素对肉鸡绝对生长高峰期骨骼肌脂肪代谢的影响

4.2 日粮脂肪酸对糖皮质激素调节效应的影响

4.2.1 高脂模型的建立

4.2.2 糖皮质激素对肉鸡骨骼肌脂肪沉积的影响

4.2.3 糖皮质激素对肉鸡骨骼肌脂肪沉积的调控作用具有组织特异性

4.2.4 糖皮质激素调控肉鸡骨骼肌脂肪酸代谢的信号通路

4.2.5 不同类型脂肪酸与糖皮质激素的互作

4.3 糖皮质激素调控肉鸡骨骼肌脂肪代谢的信号通路

4.3.1 糖皮质激素和胰岛素对鸡成肌细胞脂肪代谢的调控

4.3.2 糖皮质激素和胰岛素调控鸡成肌细胞脂肪代谢的信号通路

总体结论

研究的创新点及研究展望

6.1 研究创新点

6.2 研究展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

博士学位论文内容简介及自评

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