中药活性成分甘草酸的单克隆抗体制备及其免疫测定法的建立

论文摘要

现代研究表明,甘草酸具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、增强免疫功能等作用。甘草酸是甘草中最重要的活性成分之一,它常作为甘草及其制剂的定量指标,可用于评价药材、成药的质量、制剂的稳定性、优劣制订药品质量标准等。因此,对甘草酸的定量分析在中药的研究上具有重要的现实意义。本研究在制备甘草酸人工抗原的基础上,通过杂交瘤技术制备抗甘草酸的单克隆抗体,建立了检测甘草酸的酶联免疫吸附法（ELISA）。本实验所取得的主要结果如下:（1）采用高碘酸氧化法合成的免疫抗原GA-BSA和包被抗原GA-HSA,经基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定,在GA-BSA和GA-HSA复合物中,半抗原GA分别偶联上8个和5个。（2）用合成的GA-BSA免疫3只Balb/C小鼠,加强免疫4次后,小鼠血清效价分别达16 000:1,64 000:1和32 000:1。（3）选用血清效价高的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,阳性孔率达27.8%,经有限稀释进行亚克隆3次,筛选到9株稳定分泌抗甘草酸单克隆抗体的杂交瘤细胞,它们分别是GA1C3G6,GA1C4D4,GA1D4C10,GA5A1F4,GA6B3C10,GA7A6C5,GA8C5B10,GA10C4F9,GA10A5G5。用间接ELISA测定细胞株所产抗体的效价,挑选效价最高的细胞株GA1C4D4,GA10A5G5注射小鼠腹腔,制备腹水。（4）采用Protein G层析柱纯化腹水中的抗体,纯化后测得腹水抗体蛋白浓度在2 mg/mL以上。（5）间接ELISA测得GA1C4D4,GA10A5G5两株细胞腹水效价均在512000:1以上;利用所制得的抗GA抗体通过竞争ELISA测得GA与GA类似物的交叉反应率除甘草次酸外,其他类似物均在1%以下;抗体的亲和常数和灵敏度分别在1×10-7mol/L和0.1μg/mL左右。说明本次实验所制备的抗GA单抗的特异性、亲和力、敏感性都较好。（6）将制得的抗GA的单抗用于竞争ELISA,建立了测定甘草中甘草酸含量的方法,测定的结果与高效液相色谱测定的结果吻合。本实验的结果说明,实验所制得的抗GA的单抗可用于中药材甘草酸含量的测定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 甘草与甘草酸
• 1.1.1 甘草概述
• 1.1.2 甘草酸的结构及药理活性
• 1.2 单克隆抗体技术
• 1.2.1 单克隆抗体技术的基本原理
• 1.2.2 单克隆抗体在中药研究的应用前景
• 1.3 免疫分析方法
• 1.4 人工抗原合成的常用方法
• 1.5 本课题研究的意义和主要内容
• 1.5.1 研究意义
• 1.5.2 本研究的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 实验小鼠
• 2.1.3 中药及其活性成分标准品
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 其他耗材
• 2.2 常用溶液和培养基的配制
• 2.2.1 ELISA用试剂
• 2.2.2 细胞培养及杂交瘤筛选培养基溶液体系
• 2.2.3 纯化用缓冲液
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 GA-BSA免疫抗原及GA-HSA包被抗原的合成
• 2.3.2 GA-BSA,GA-HSA的分子量的测定
• 2.3.3 抗GA MAb的制备
• 2.3.4 抗GA MAb特性的鉴定
• 2.3.5 建立ELISA法测定甘草中GA的含量
• 3 实验结果
• 3.1 GA-BSA,GA-HSA人工抗原的合成产率
• 3.2 人工抗原分子量鉴定
• 3.2.1 GA-BSA的紫外光谱扫描鉴定
• 3.2.2 MALDI-TOF-MS鉴定
• 3.3 血清效价测定结果
• 3.4 血清抗体特异性测定结果
• 3.5 细胞融合后结果观察
• 3.6 杂交瘤细胞的筛选结果
• 3.7 腹水纯化及抗体浓度测定结果
• 3.8 抗GA MAb的SDS-PAGE分析
• 3.9 抗GA MAb的分子量鉴定
• 3.10 抗GA MAb性质的鉴定
• 3.10.1 腹水MAb的效价测定
• 3.10.2 抗GA MAb的特异性测定（交叉反应）结果
• 3.10.3 抗GA MAb的亲和力测定结果
• 3.10.4 抗GA MAb的敏感性测定结果
• 3.11 ELISA法测定GA含量方法的建立
• 3.11.1 GA的ELISA测定
• 3.11.2 GA的HPLC测定
• 4 讨论
• 5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录