论文摘要
研究目的：Midkine（MK）又称为神经轴突生长促进因子-2（neuritegrowth-promoting factor 2），是1988年发现的肝素结合生长因子。人类MK在妊娠中期胎儿上皮-间叶组织和神经组织中高表达，维持细胞生长，促进细胞迁移，对胎儿上皮和神经组织等的发育有重要作用。成人MK主要表达在血管内皮细胞和某些器官的粘液上皮细胞，其它组织表达很低甚至检测不到。多种人类实体肿瘤存在MK表达的明显增高，并且其表达水平与预后呈负相关，但是MK在急性白血病中的表达情况却知之甚少。在本研究中，我们检测了MK基因在急性白血病（AL）的表达水平并初步探讨了AML1、AML1-ETO对MK基因转录的调节作用及MK在白血病发病中的作用。研究方法：1．应用实时定量逆转录PCR(real-time quantitiveRT-PCR（RQ-RT-PCR），对181例急性白血病患者（AL），其中初诊及复发患者158例、完全缓解患者23例，31例正常人骨髓标本进行了MK转录本的检测。2．在MK基因组中扩增5段含有AML1可能结合位点的序列，定向克隆入pGL3-Basic及pGL3-Promoter报告基因表达载体，将该载体与AML1和AML1-ETO基因真核表达载体瞬时转染CV-1细胞，分析AML1、AML1-ETO对报告基因的转录调节作用。3．构建含有MK开放读码框的pMK-IRES2-EGFP载体，转染小鼠Pro-B细胞系BA/F3，筛选MK稳定表达细胞株，通过与转染空载体的BA/F3细胞进行比较，研究MK在血液系统疾病发病中的作用。结果：1．MK在急性白血病患者、正常供者和完全缓解（CR）患者均有表达，AL进展期患者MK表达显著高于正常人及CR患者（P＜0．001及P＜0．05），正常人与CR患者的MK表达无统计学差异。MK的表达在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）各亚型（包括pro-B-ALL，common-B-ALL，pre-B-ALL）及各年龄段均有显著升高（P＜0．001），且与T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）及急性髓系白血病（AML）各FAB亚型间均有显著性差异（P值均＜0．001）；与正常人相比，M2亚型患者MK表达明显升高（P＜0．001），与AML其他FAB亚型相比有显著性差异（P值均＜0．05）；M3患者MK表达也较正常人明显升高（P＜0．05），但与除B-ALL和M2外的其他白血病亚型间差异无统计学意义。CD34+患者较CD34-患者MK表达显著升高（P＜0．01），AML-1/ETO融合基因阳性的M2患者较阴性的M2患者MK表达显著升高（P＜0．05）。2．生理剂量的AML1能够轻度提高含有AML1可能结合位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区的MKPⅠ-Ⅲ-pGL3-Basic Luciferase报告基因的表达，AML1-ETO能够抑制上述由AML1诱导的MKPⅠ-Ⅲ-pGL3-Basic-pGL3-BasicLuciferase报告基因表达的作用。而生理剂量的AML1和AML1-ETO对含有AML1可能结合位点Ⅳ、Ⅴ区的MKPVⅣ-Ⅴ-pGL3-BasicLuciferase及MKPⅠ-Ⅲ-pGL3-Promoter Luciferase则无明显调节作用。3．转染pMK-IRES2-EGFP和pIRES2-EGFP的BA/F3细胞经多次筛选亚克隆后获得稳定表达MK及空载体的克隆，细胞计数实验和集落形成实验显示高表达MK的BA/F3细胞在不同IL-3浓度条件下具有更强的体外增殖能力，在半固体培养基中的集落形成能力增强；逐步降低IL-3浓度后通过Annexin-V/7-AAD检测凋亡发现，转染了MK的BA/F3克隆较转染空载体的克隆早期凋亡细胞明显减少，而晚期凋亡差别不明显。结论：B-ALL、M2和M3型白血病患者中均存在中期因子基因不同程度的表达升高。生理剂量的AML1对MK表达具有一定的促进作用，AML1-ETO可抑制AML1促进MK表达的作用。MK基因通过促进增殖和抑制凋亡促进急性白血病的发生发展。
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