论文摘要
目的探索胰岛β细胞分离纯化的方法，寻找大鼠胰岛β细胞体外原代培养的适宜条件。方法选用正常喂养的Wistar大鼠（雌雄不限，7-8周龄，体重250-300克），采用经胆总管插管注入胶原酶的方法对大鼠胰腺进行消化，然后分别以20目和80目的不锈钢网筛过滤初步纯化胰岛，双硫腙染色及葡萄糖刺激试验鉴定胰岛及其活性。分离纯化后的胰岛在RPMI-1640培养基中过夜培养。培养后的胰岛经洗涤沉降等处理后，以胰蛋白酶和DNA酶再次消化，形成胰岛的单细胞悬液。将单细胞悬液置于2．8mmol／L葡萄糖液，用流式细胞仪（BD FACSAria）以100mW，488nm的激光照射，分选510nm～550nm处的细胞。用免疫组织化学染色法及不同浓度葡萄糖刺激试验鉴定分选细胞及其活性，将所分选β细胞置于不同葡萄糖和IBMX浓度的Ham’s F-10培养基中培养，观察IBMX对β细胞活性的影响。结果实验大鼠胰腺经过胶原酶消化和初步纯化后，平均每只大鼠可获得550±95个胰岛，DTZ染色及葡萄糖刺激试验证明胰岛活性良好。进行FACS后，平均每只大鼠可得到约5688个β细胞，回收率为93．69％，分离纯度为85．5％。将β细胞置于不同浓度葡萄糖和IBMX的Ham’sF-10培养基中，在较高浓度葡萄糖条件下（10．0mmol／L及16．0mmol／L），β细胞活性较高，死亡和凋亡也较少。未观察到IBMX对β细胞活性的影响。结论1、从正常喂养的健康大鼠分离纯化所得的胰岛经过胰蛋白酶及DNA酶再次消化后，形成的单细胞悬液，在外界葡萄糖浓度为2．8mmol／L时可用FACS对β细胞进行分选纯化，但是所得细胞的纯度尚不太理想；2、在β细胞进行原代培养时，初步实验证明在外界葡萄糖浓度较高时（大于10．0mmol／L），β细胞可保持较高的活性，尚未发现IBMX对细胞活性有无影响。因此，有待于大规模的实验进一步寻找最适宜的体外原代β细胞生长环境以及提高其成活率。