对虾养殖沉积环境细菌多样性的分子分析与若干可培养技术优化探讨

论文摘要

传统的微生物纯培养技术能够分离得到的微生物仅为自然界中微生物总数的1%左右,绝大多数微生物还处于未培养和未研究状态,针对新型培养技术的探索已经成为了研究热点。本论文在传统微生物培养技术的基础上进行改进,对泉州湾滩涂虾池表层沉积物中的细菌进行富集培养,并运用变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术对培养后的细菌多样性变化进行比较和研究;同时,对虾池表层沉积物样品总DNA以及多种固体培养基富集后培养物的总DNA的DGGE图谱中16SrDNA片段的显著条带进行切割、克隆和测序,并进行系统发育分析。本研究取得了以下主要结果:1.对虾池表层沉积物细菌多样性进行分析,得出该沉积环境细菌多样性指数为3.4971,丰度为41,均匀度指数为0.94171;对DGGE图谱上的特征条带进行切割回收和克隆测序后得到了优势菌的信息。测序结果为:17个优势条带分别属于变形菌门、α-变形菌纲、γ-变形菌纲、δ-变形菌纲、ε-变形菌纲、绿弯菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和环境样品中的未知菌群等10个类群,其中有15个条带的序列与各个门类中未培养细菌具有大于98%的同源性。2.采用直接接种（Ⅰ）和稀释接种（Ⅱ）等2种接种方式、匀速摇动（Y）和间歇扰动（R）等2种培养方式以及2216E、D2216E、VL55、DNB、HM1、HM2、DR2A和R2A等8种液体培养基对虾池表层沉积物细菌进行为期2周的富集培养,结合各样品的DGGE图谱和细菌多样性指数,对接种方式、培养方式的改进效果和各种培养基的使用效果做出评价,结果表明:ⅠY和ⅡR方式可以适用于大多数液体培养基,低营养基质培养基比高营养基质培养基更能获得较多的DGGE条带和较高细菌多样性。3.采用A2216E、AD2216E、AVL55、ADNB、AHM1、AHM2、ADR2A、AR2A和G2216E、GD2216E、GVL55、GDNB、GHM1、GHM2、GDR2A、GR2A等16种固体培养基对虾池表层沉积物细菌进行为期12周以上的富集培养,菌落计数结果显示:AVL55、GVL55、GDNB、GHM2和GDR2A等培养基在2周和12周的菌落计数结果还有明显的增长;将2周富集培养物DGGE图谱中的显著条带进行切割回收和克隆测序,得到培养后的优势菌落信息。测序结果为:19个显著条带分别属于γ-变形菌纲、α-变形菌纲、ε-变形菌纲、厚壁菌门、海洋细菌和环境样品中的未知菌群等6个类群,其中有9个条带的序列与各门类中未培养细菌具有大于98%的同源性。4.成功的将新型微生物胞外多糖——结冷胶（Gellan gum）应用于固体培养基的配制,与琼脂相比,结冷胶具有用量少、成胶质量高、胶体透明度高、性质稳定等优点。实验证明,对比8种培养基的结冷胶平板和琼脂平板,除了常规使用的2216E培养基外,其它7种培养基的结冷胶平板均能获得比琼脂平板具有更高多样性指数、丰度和均匀度指数的富集培养物;其中,以GDNB和GDR2A培养基的各项指数为最高。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1. 前言
• 1.1 我国对虾养殖业以及病害控制简况
• 1.1.1 我国对虾养殖业的发展简况
• 1.1.2 抗生素在病害控制中的应用
• 1.1.3 抗菌肽及其应用前景
• 1.2 微生态制剂在水产养殖中的应用
• 1.2.1 微生态制剂的定义
• 1.2.2 微生态制剂在水产养殖中的应用
• 1.2.3 微生态制剂的缺陷
• 1.3 微生物培养技术的局限性以及改进策略
• 1.3.1 传统微生物纯培养技术的局限性
• 1.3.2 微生物培养技术的改进策略
• 1.3.3 结冷胶技术的研究进展
• 1.4 分子生态学技术方法及其应用
• 1.4.1 从自然环境中提取核酸
• 1.4.2 分子杂交法
• 1.4.3 基于PCR 的指纹图谱分析法
• 1.4.4 变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术及其应用
• 1.5 本论文的研究思路、内容和意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 采样地点概况与样品采集
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 工具酶
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 主要仪器
• 2.1.7 培养基
• 2.1.8 溶液配制
• 2.1.9 分析软件
• 2.2 基本方法
• 2.2.1 虾池表层沉积物样品的采集和环境参数的测定
• 2.2.2 虾池表层沉积物总菌和异养细菌计数
• 2.2.3 沉积物细菌的培养
• 2.2.4 培养前后沉积物细菌群落结构变化与优势菌的分析
• 2.2.5 细菌遗传多样性的统计学分析
• 3. 结果与分析
• 3.1 虾池的环境因子分析
• 3.1.1 虾池的基本概况
• 3.1.2 虾池主要环境因子
• 3.2 虾池表层沉积物的细菌计数分析
• 3.2.1 虾池表层沉积物总菌计数
• 3.2.2 培养期内可培养异养菌计数
• 3.3 虾池表层沉积物的细菌多样性分析
• 3.3.1 表层沉积物细菌总DNA 的提取
• 3.3.2 表层沉积物细菌16SrDNA-V3 高变区的PCR 扩增
• 3.3.3 DGGE 基因指纹图谱的构建与细菌多样性分析
• 3.3.4 表层沉积物细菌优势种群的分子鉴定与系统发育分析
• 3.4 富集培养后虾池表层沉积物的细菌群落结构分析
• 3.4.1 液体培养基富集培养后虾池表层沉积物的细菌群落结构分析
• 3.4.2 固体培养基富集培养后虾池表层沉积物的细菌群落结构分析
• 4. 讨论
• 4.1 微生物培养技术改进策略的选择以及实施
• 4.1.1 培养基的选择
• 4.1.2 接种方式和培养方式的选择
• 4.1.3 培养时间的界定
• 4.1.4 固体培养基凝固剂的选择
• 4.2 虾池表层沉积物中优势种群的分析
• 4.3 固体培养基富集培养后特征种群的分析
• 4.4 关于变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术在应用中的若干问题
• 5 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 附录一 攻硕期间参与的课题
• 附录二 载体图谱
• 附录三 DNA 分子量标准
• 附录四 缩略语对照表
• 附录五 整理待发表的文章
• 致谢